陳兆紅 何迎盈 張友才 魯丁瑜

膽囊癌是最常見的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有早期診斷困難，惡性程度高，同時(shí)預(yù)后極差的特點(diǎn)[1]。盡管新的針對(duì)膽囊癌治療的手段和方案在不斷的更新改進(jìn)，但治療效果卻并不理想。膽囊癌患者的預(yù)后并未得到顯著改善，其5年生存率始終低于5%。所以探尋新的治療靶點(diǎn)，總結(jié)有效治療方法顯得尤為重要。

SOX7屬于SRY相關(guān)基因家族。該家族能夠編碼一系列重要的轉(zhuǎn)錄因子，其共同特點(diǎn)是具有一個(gè)保守的HMG-box DNA結(jié)合域。近年來，有研究表明，SOX7(Sex determining region Y-box 7)基因的表達(dá)異常參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2-4]。但是，SOX7基因與膽囊癌的關(guān)系以及該基因是否影響膽囊癌細(xì)胞生物學(xué)特性還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用特異性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞，挑選穩(wěn)定過表達(dá)SOX7基因的GBC-SD細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)該細(xì)胞增殖、凋亡情況，并進(jìn)一步探索其可能牽涉的細(xì)胞信號(hào)通路，探索膽囊癌的治療新靶點(diǎn)，為膽囊癌的治療提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 膽囊癌GBC-SD細(xì)胞系

膽囊癌GBC-SD細(xì)胞系購于美國(guó)ATCC(American type culture collection)。RPIM-1640(Hyclone公司)作為細(xì)胞培養(yǎng)基，其中添加有10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 IU/mL。

1.2 儀器和試劑

酶標(biāo)儀購于美國(guó)Thermo公司；熒光顯微鏡購于美國(guó)FAS scan公司；Edu細(xì)胞增殖試劑盒、Hoechst 33342細(xì)胞凋亡試劑盒購于聯(lián)科生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購于日本東仁化工公司；蛋白抗體Akt、p-Akt、PTEN及β-actin購自于美國(guó)Santa cruz公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)與方法

1.3.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與篩選 從上海生工有限公司購得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SOX7及其陰性空載體pc-DNA3.1-mock。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的GBC-SD細(xì)胞接種于24孔板中。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，每孔按照質(zhì)粒與脂質(zhì)體體積為1∶2.5加入1 mL無血清培養(yǎng)基中共培養(yǎng)8 h，之后將培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)。之后將細(xì)胞以1∶3的比例分孔繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后用添加了600 μg/mL的G418培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定篩選。2周之后，挑選生長(zhǎng)良好的細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)增。以pc-DNA3.1-mock轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照組，以pcDNA3.1-SOX7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組參與后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞活性檢測(cè) 將GBC-SD細(xì)胞制備成混懸液，并以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板。孵育72 h后用100 μL的細(xì)胞培養(yǎng)基RPIM-1640與10 μL的CCK-8試劑混勻，加入各孔之中。再將96孔板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度(OD)值，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為450 nm。

1.3.3 Real-time PCR檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GBC-SD細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA。按cDNA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Takara公司)產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。將2 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增。SOX7序列：上游：5′-CAAGATGCTGGGAAAGTCGT-3′，下游：5′-CCGGTACTTGTAGTTGGGGTAGT-3′。內(nèi)參GAPDH序列：上游：5′-AGCCTCAAGATCATCAGCAAT-3′，下游：5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCACG-3′。引物購自上海生工有限公司。反應(yīng)體系總體積20 μL，其中模板cDNA為1.5 μL，上下游引物分別為1 μL，SYBR混合物10 μL，無菌蒸餾水1.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，然后95℃預(yù)變性10 s，緊接著60℃退火30 s。再于70℃延伸30 s。以GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 Hoechst 33342細(xì)胞染色 將已制備好的細(xì)胞爬片用PBS浸洗三次，然后于4%多聚甲醛固定1 h。PBS清洗三遍，將玻片浸泡在裝有Hoechst33342染液的染色缸中，避光10 min；在340 nm的激發(fā)光下觀察：熒光顯微鏡(×100)下，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)?；罴?xì)胞呈彌散均勻熒光，凋亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。如果見到3個(gè)或3個(gè)以上的DNA熒光碎片被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。

1.3.5 Edu細(xì)胞熒光染色法 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的GBC-SD細(xì)胞，以每孔300個(gè)活細(xì)胞接種于96孔板中，置于細(xì)胞孵箱中48 h。用細(xì)胞培養(yǎng)基1 000∶1的比例稀釋Edu溶液，制備適量50 μM的Edu培養(yǎng)基，每孔加入100 μL稀釋后的Edu，孵育1 h，棄去培養(yǎng)基，之后用PBS清洗細(xì)胞2次，每次5 min，每孔加入100 μL 4%多聚甲醛的室溫孵育30 min之后每孔加入2 mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5 min，棄甘氨酸溶液；PBS清洗5 min，0.5% Triton X-100破膜10 min；PBS清洗1次。DAPI染色完成后，熒光顯微鏡觀察。以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，熒光顯微鏡(×100)下隨機(jī)取五個(gè)視野，計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)及Edu染色陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，相對(duì)細(xì)胞增殖比例=(Edu染色陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))/(對(duì)照組Edu染色陽性細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組總細(xì)胞數(shù))。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞用RIPA裂解，制作細(xì)胞裂解液。等量蛋白采用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入特異性一抗，然后4℃過夜孵育。TBST洗膜3次，每次5 min，室溫下孵育1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光和曝光顯影。其中β-actin、GAPDH、SOX7、PTEN、Akt及p-Akt的濃度分別是：1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶3 000。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)SOX7基因影響GBC-SD細(xì)胞的活性

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組SOX7基因在mRNA水平的表達(dá)量為(100.0±2.3)%，而實(shí)驗(yàn)組SOX7 mRNA的相對(duì)達(dá)量為(353.0±28.1)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.54，P<0.001)(圖1A)。將穩(wěn)定過表達(dá)SOX7基因的細(xì)胞制備成混懸液，分別接種到96孔板中，定期測(cè)量細(xì)胞活性。72 h后，對(duì)照組的細(xì)胞在450 nm激發(fā)光下吸光度值為(4.6±0.4)，而實(shí)驗(yàn)吸光度值為(2.4±0.2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)(圖1B)。

圖1 過表達(dá)SOX7基因?qū)BC-SD細(xì)胞活性的影響Figure 1 Effects of SOX7 overexpression on the mRNA expression and cell viability of GBC-SD cells

2.2 過表達(dá)SOX7影響GBC-SD細(xì)胞的增殖、凋亡

將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別接種到96孔板中，48 h后采用Edu免疫熒光染色觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)照組細(xì)胞增殖比例為(33.3±3.4)%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖比例為(12.2±4.2)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.76，P=0.0025)(圖2)。同時(shí)，Hoechst 33342細(xì)胞凋亡熒光染色結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞凋亡比例為(5.2±1.3)%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡比例為(10.2±2.4)%，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡比例高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.17，P=0.0338)(圖3)。

2.3 過表達(dá)SOX7基因?qū)BC-SD細(xì)胞PTEN/Akt信號(hào)通路的影響

分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總蛋白，采用Western blot檢測(cè)PTEN、Akt及p-Akt蛋白的表達(dá)。PTEN蛋白在對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量為(0.2±0.02)，而在實(shí)驗(yàn)組中為(0.7±0.04)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.36，P=0.0001。對(duì)照組中Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(0.6±0.01)，實(shí)驗(yàn)組為(0.6±0.03)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0，P=0.2)。p-Akt蛋白在對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量為(0.8±0.03)，在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)為(0.4±0.02)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.2，P<0.0001)(圖4)。

圖2 過表達(dá)SOX7對(duì)GBC-SD細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Effects of SOX7 overexpression on cell proliferation of GBC-SD cells

圖3 過表達(dá)SOX7對(duì)GBC-SD細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effects of SOX7 overexpression on cell apoptosis of GBC-SD cells

圖4 SOX7過表達(dá)對(duì)GBC-SD細(xì)胞PTEN/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effects of SOX7 overexpression on PTEN/Akt signal pathways of GBC-SD cells

3 討論

SOX(SRY related high mobility group box)家族的共同特征是具有一類高保守的HMG結(jié)構(gòu)域，該家族編碼的蛋白廣泛參與機(jī)體眾多生理過程，如性別決定、調(diào)節(jié)胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、軟骨形成、血細(xì)胞生成、晶狀體的發(fā)育等多臟器的分化。研究表明，該家族不僅參與人體正常生理過程，同時(shí)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起到重要作用[5]。其中，SOX7是SOX基因家族的一個(gè)重要成員。有研究表明，SOX7基因的異常表達(dá)與口腔癌關(guān)系密切，在口腔鱗狀上皮癌組織中的表達(dá)低于癌旁的正常組織，抑制SOX7基因的表達(dá)，明顯增強(qiáng)口腔鱗狀上皮癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)轉(zhuǎn)移[3]。同樣，在乳腺癌組織中SOX7基因表達(dá)低于正常組織，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展呈負(fù)相關(guān)[6]。在卵巢癌中，SOX7在進(jìn)展期腫瘤中的表達(dá)明顯降低[7]。

SOX7基因在上述腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，但是SOX7與膽囊癌的關(guān)系目前尚未知曉。通過構(gòu)建SOX7過表達(dá)細(xì)胞株，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)過表達(dá)SOX7后膽囊癌GBC-SD細(xì)胞活性顯著下降。為了更進(jìn)一步的了解其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，我們采用了Edu細(xì)胞熒光染色與Hoechst 33342細(xì)胞染色分別檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡的情況。結(jié)果表明，過表達(dá)SOX7基因之后，GBC-SD細(xì)胞的增殖顯著被抑制，同時(shí)，細(xì)胞凋亡卻顯著增加。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，證實(shí)在膽囊癌中，SOX7基因發(fā)揮抑癌基因功能。

在腫瘤細(xì)胞中，PTEN/Akt信號(hào)通路廣泛參與了細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等多個(gè)過程[8-10]。已有研究表明，SOX家族基因與PTEN信號(hào)通路的抑制有一定的關(guān)聯(lián)[6]。而有研究報(bào)道PTEN/Akt通路在膽囊癌細(xì)胞的增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用[11-12]。據(jù)此，我們推測(cè)PTEN/Akt細(xì)胞信號(hào)通路可能參與SOX7對(duì)膽囊癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。通過Western blot實(shí)驗(yàn)，我們首次證實(shí)過表達(dá)SOX7促使GBC-SD細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)增加，降低Akt蛋白的磷酸化。上述結(jié)果說明，SOX7基因能夠通過調(diào)節(jié)PTEN/Akt信號(hào)通路影響膽囊癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。

綜上所述，過表達(dá)SOX7能夠抑制膽囊癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，PTEN/Akt通路的抑制可能參與該過程。本研究的結(jié)果證明過表達(dá)SOX7基因能夠抑制膽囊癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，為膽囊癌的臨床治療提供參考。