王祁民 馬銀玲 安靜 張磊 孫利民 白萬(wàn)軍 溫艷虹 董占軍

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）13-1790-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.15

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定消癌平片中通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I含量的方法。方法：取消癌平片經(jīng)三氯甲烷萃取后采用高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)樣分析。色譜柱為Symmetry C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），檢測(cè)波長(zhǎng)為223 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。采用上述條件測(cè)定3批樣品中通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I的含量。結(jié)果：通關(guān)藤苷A、通關(guān)藤苷I的質(zhì)量濃度檢測(cè)線性范圍分別為26.40～264.00 μg/mL（r=0.999 4）、4.59～45.90 μg/mL（r=0.999 3），檢測(cè)限分別為0.26、0.12 μg/mL，定量限分別為0.79、0.36 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（12 h）、重復(fù)性試驗(yàn)峰面積的RSD均<2.0%（n=6）；加樣回收率分別為98.53%～99.28%（RSD為0.20%～0.51%，n=9）、97.00%～98.89%（RSD為0.19%～1.03%，n=9）。3批樣品中通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I的含量分別為2.27～2.32、0.64～0.69 mg/g。結(jié)論：本試驗(yàn)建立的方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于消癌平片中通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法； 消癌平片； 通關(guān)藤苷A； 通關(guān)藤苷I；含量測(cè)定

ABSTRACT OBJECTIVE： To develop a method for simultaneous determination of tenacissoside A and tenacissoside I in Xiaoaiping tablets. METHODS： HPLC method was used to analyze Xiaoaiping tablets after extracted by trichlormethane. The determination was performed in Symmetry C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 223 nm， and the column temperature was 25 ℃. The sample size was 20 μL. The content of tenacissoside A and tenacissoside I in 3 batches of samples were determined by above condition. RESULTS： The linear range of tenacissoside A and tenacissoside I were 26.40-264.00 μg/mL （r=0.999 4） and 4.59-45.90 μg/mL （r=0.999 3）， respectively. The limits of detection were 0.26， 0.12 μg/mL， and the limits of quantification were 0.79， 0.36 μg/mL. RSDs of precision， stability （12 h） and repeatability tests were all lower than 2.0%（n=6）. The recoveries were 98.53%-99.28% （RSD=0.20%-0.51%，n=9） and 97.00%-98.89% （RSD=0.19%-1.03%，n=9）. The contents of tenacissoside A and tenacissoside I in 3 batches of samples were 2.27-2.32 mg/g and 0.64-0.69 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： The established method is accurate， simple and reliable， which is suitable for simultaneous determination of tenacissoside A and tenacissoside I in Xiaoaiping tablets.

KEYWORDS HPLC； Xiaoaiping tablets； Tenacissoside A； Tenacissoside I； Content determination

消癌平片為通關(guān)藤單味藥材提取所制，具有抗癌、消炎、平喘的功效，臨床主要用于單獨(dú)或配合放、化療及手術(shù)后的肝癌、食管癌、胃癌、肺癌等惡性腫瘤[1-6]的治療，其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅以綠原酸為測(cè)定指標(biāo)[7]，代表性不足。參考文獻(xiàn)[8-9]，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定消癌平片中抗腫瘤主要活性成分通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I的含量，以便對(duì)消癌平片質(zhì)量進(jìn)行更全面、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的控制。通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I結(jié)構(gòu)式見圖1。

1 材料

1.1 儀器

2695HPLC儀，包括2487紫外檢測(cè)器、E2695四元梯度泵、Empower3分析軟件、自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Waters公司）；AB204-S分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ3200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

消癌平片（長(zhǎng)春銀諾克藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20160601、20160411、20160508，規(guī)格：0.3 g/片）；通關(guān)藤苷A對(duì)照品（山西省中醫(yī)藥研究院，批號(hào)：20130513，純度：>98%）；通關(guān)藤苷I對(duì)照品（深圳遠(yuǎn)揚(yáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20160311，純度：>98%）；甲醇和乙腈均為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，32%A；10～10.01 min，32%→42%A；10.01～15 min，42%A；15～15.01 min，42%→50%A；15.01～28 min，50%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：223 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取通關(guān)藤苷A對(duì)照品和通關(guān)藤苷I對(duì)照品33.02、22.01 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，制得對(duì)照品溶液Ⅰ（通關(guān)藤苷A質(zhì)量濃度為3.30 mg/mL）及對(duì)照品溶液Ⅱ（通關(guān)藤苷I質(zhì)量濃度為2.20 mg/mL）。取對(duì)照品溶液Ⅰ8 mL、對(duì)照品溶液Ⅱ1.7 mL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取消癌平片，去除糖衣，研細(xì)，即得消癌平片粉末。精密稱取消癌平片粉末0.55 g，置于60 mL分液漏斗中，加入三氯甲烷6 mL，純化水24 mL，搖勻，靜置。取有機(jī)層，連續(xù)萃取3次，將所制得溶液蒸干，用甲醇復(fù)溶并定容至10 mL量瓶中，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白對(duì)照溶液 稱取生產(chǎn)廠家處方中所添加各種輔料適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備空白對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，各待測(cè)成分間、待測(cè)成分與雜質(zhì)峰間均能達(dá)到基線分離，分離度>1.5，色譜圖見圖2。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液20、40、80、120、160、200 μL，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I的回歸方程分別為y=9 499.8x+9 251.30（r=0.999 4）、y=13 770x-3 764.40（r=0.999 3）。結(jié)果表明，通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為26.40～264.00、4.59～45.90 μg/mL。

2.5 檢測(cè)限與定量限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限。結(jié)果表明，通關(guān)藤苷A的檢測(cè)限和定量限分別為0.26、0.79 μg/mL，通關(guān)藤苷I的檢測(cè)限和定量限分別為0.12、0.36 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，每次20 μL，記錄峰面積。結(jié)果顯示，通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I峰面積的RSD分別為0.36%、0.52%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液（批號(hào)：20160601）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I峰面積的RSD分別為0.26%、0.17%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取消癌平片（批號(hào)：20160601）粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I峰面積的RSD分別為1.05%、1.45%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取消癌平片（批號(hào)：20160601）粉末，共9份，每份約0.30 mg，精密稱定，分別置于25 mL分液漏斗中，各加入低、中、高質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I加樣回收率分別為98.53%～99.28%（RSD為0.20%～0.51%，n=9）、97.00%～98.89%（RSD為0.19%～1.03%，n=9），表明方法準(zhǔn)確度較高。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，消癌平片中通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I含量分別為2.27～2.32、0.64～0.69 mg/g，樣品含量測(cè)定結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

筆者在前期試驗(yàn)中采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了同時(shí)測(cè)定通關(guān)藤藥材中3種皂苷通關(guān)藤苷A、H、I的含量[10]。由于消癌平片為通關(guān)藤經(jīng)水多次煎煮濃縮而成，其各成分含量理論比藥材中高。本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[11-12]建立了較為普適的HPLC-紫外檢測(cè)器法的條件，對(duì)消癌平片中2種活性成分通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果顯示，此方法能準(zhǔn)確、靈敏地對(duì)2種成分進(jìn)行定性、定量分析。

3.2 質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇

消癌平中含有C21甾體皂苷類、三萜類、多糖類、酚酸類等化學(xué)成分[8-9]。綠原酸存在于金銀花、杜仲等多種中藥植物中，對(duì)通關(guān)藤及消癌平的研究多集中在綠原酸等酚酸類成分，如謝麗艷、張阿琴等[13-14]報(bào)道消癌平注射液中綠原酸、咖啡酸、香草酸等酚酸類成分的含量測(cè)定方法。通關(guān)藤及消癌平抗腫瘤主要活性成分為C21甾體皂苷（即通關(guān)藤苷及其苷元），目前從通關(guān)藤中鑒定分離出50多種通關(guān)藤苷及其苷元[15]，對(duì)其成分功效的研究還處于初步階段。通關(guān)藤苷不僅對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901、小鼠肉瘤細(xì)胞S180、小鼠淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞P388有顯著的體內(nèi)抑制作用[16]，還可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，使甲胎蛋白分泌量降低[17]，對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷也具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其減少自由基產(chǎn)生、提高抗氧化物酶活性有關(guān)[18]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]關(guān)于通關(guān)藤的含量測(cè)定引入了通關(guān)藤苷H指標(biāo)成分，在消癌平注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[19]中含量測(cè)定引入了通關(guān)藤苷A指標(biāo)成分。本研究在參照國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[7，19]基礎(chǔ)上，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選擇了含量較高的通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I[11-12]作為質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.3 色譜條件的選擇

3.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng) 通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I屬于C21甾體皂苷類化合物，是一類苷元為孕甾烷衍生物與2-脫氧糖等形成的苷，在紫外末端有吸收。文獻(xiàn)報(bào)道，通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I的最大吸收波長(zhǎng)分別為223 nm[1]和230 nm[11]。筆者在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在223 nm波長(zhǎng)處通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I峰形均良好。因此，選擇223 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3.2 流動(dòng)相 筆者在預(yù)試驗(yàn)中曾用乙腈和水等度洗脫，通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I色譜峰的分離度小于1.5，而選用乙腈和磷酸溶液梯度洗脫后，30 min內(nèi)即可完成對(duì)樣品的分析，通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I均能得到較好的峰形及分離度大于1.5，故本試驗(yàn)最終采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相并進(jìn)行梯度洗脫。

綜上所述，本研究建立的方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于消癌平片中通關(guān)藤苷A和通關(guān)藤苷I含量的同時(shí)測(cè)定。

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（收稿日期：2018-03-01 修回日期：2018-05-22）

（編輯：余慶華）