華 瑩

珠?；羝战鹚贯t(yī)藥研究院股份有限公司(珠海 519000)

主題詞 五加 糖尿病，2型/藥物療法 生物黃酮類/藥物作用 糖尿病，實(shí)驗(yàn)性 模型，動(dòng)物 小鼠

短梗五加(Acanthopanax sessiliflorus Seem)又稱五加參、無(wú)梗五加，系五加科五加屬落葉灌木或小喬木植物[1-2]。原產(chǎn)地主要是分布于我國(guó)的東北黑龍江密山市完達(dá)山支脈-青梅山、吉林省安圖市和撫松縣、遼寧省千山以及俄羅斯和朝鮮[1-2]。短梗五加中的主要活性成由黃酮類、皂苷、木脂素、揮發(fā)油、有機(jī)酸等組成[3]。2008年國(guó)家衛(wèi)生部已經(jīng)批準(zhǔn)短梗五加為新能源食物，其莖既是傳統(tǒng)的食用珍品，更是具有降血糖、降血脂、強(qiáng)心、健胃利尿的藥用保健佳品[4-9]。

近年來(lái)，對(duì)于天然中藥植物中的成分研究成為了熱點(diǎn)，利用食補(bǔ)替代藥補(bǔ)成為了健康保健品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。本研究為了探討短梗五加莖黃酮(Flavonoid of acanthopanax sessiliflorus Seem，F(xiàn)ASS)對(duì)2型糖尿病(Type-II Diabetes mellitus，IIDM)及其并發(fā)癥的治療作用，首先利用高糖高脂日糧結(jié)合注射一定劑量的鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病(Non-insulin dependent diabetes mellitus，NIDDM)模型Balb/C小鼠，然后對(duì)模型小鼠進(jìn)行不同劑量的FASS和二甲雙胍藥物作為陽(yáng)性對(duì)照灌胃處理，從而研究FASS對(duì)2型糖尿病小鼠降糖效果，不僅為日后開(kāi)發(fā)天然降糖藥物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持，更可以為長(zhǎng)白山地區(qū)短梗五加中其它藥用活性成分的利用提供技術(shù)參數(shù)。

材料與方法

1 材 料 本研究材料為2017年5月中旬采自吉林省安圖市林場(chǎng)(129.07 E；43.08N)的短梗五加莖，經(jīng)鑒定為短梗五加(Acanthopanax sessiliflorus Seem)的莖。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，購(gòu)于美國(guó)索萊寶公司；二甲雙胍緩釋片(Metformin hydrochloride sustained release tablets，MHSRT)，購(gòu)于中美上海施貴寶制藥有限公司；總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等檢查試劑盒，購(gòu)于上海生物工程試劑有限公司；其他生化試劑，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

170只健康Balb/C小鼠(雌雄各半)，體重(20.0 ± 1.0)g，購(gòu)于吉林大學(xué)小動(dòng)物中心。將Balb/C小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，室內(nèi)通風(fēng)條件良好，晝夜變化正常，相對(duì)濕度在50%～65%，室溫在19 ～ 23 ℃。在建立2型糖尿病(Non-insulin dependent diabetes mellitus，NIDDM)模型小鼠前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。常規(guī)日糧，購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料公司，其中蛋白質(zhì)含量為20%、碳水化合物含量為55%、脂肪含量為8%和纖維素含量為10%。高糖高脂日糧，由本實(shí)驗(yàn)篩選獲得，1000 kg的高糖高脂日糧的配方是由690 g/kg常規(guī)日糧，添加150 g/kg的蔗糖、150 g/kg的豬油和10 g/kg膽固醇組成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 短梗五加莖黃酮的提?。喝《坦Ｎ寮幽矍o烘干至恒重，研磨粉碎，過(guò)60目篩，精確稱量1.0 g，按照料液比1∶5浸泡在85%乙醇處理12～14 h，再在35℃條件下超聲波處理1 h，然后用索氏回流提取2次，每次3～5 h，收集合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀。加入500 ml的蒸餾水溶解濃縮物，再加入等量的石油醚萃取，共計(jì)萃取5次，最后收集水相層溶液并置于恒溫水浴上蒸至100 ml，利用凍干機(jī)冷凍干燥過(guò)夜，最后收獲得到短梗五加黃酮粗干燥粉末。

2.2 2型糖尿病小鼠模型(NIDDN)的構(gòu)建：取170只健康Balb/C小鼠，嚴(yán)格標(biāo)記并測(cè)定體質(zhì)量，更換飼喂本實(shí)驗(yàn)室篩選配置好的高糖高脂日糧24 d，然后用5.0 mg/ml STZ(現(xiàn)用現(xiàn)配)以20 mg/kg的注射劑量進(jìn)行腹腔注射處理，記錄注射處理的時(shí)間，72 h后測(cè)定小鼠血糖值，當(dāng)測(cè)定的小鼠血糖值大于12.0 mmol/L時(shí)，可判定該小鼠為2型糖尿病小鼠模型(NIDDN模型小鼠)。同時(shí)，記錄模型小鼠的生理狀態(tài)，這時(shí)的模型小鼠與普通小鼠相比具有多食、多飲、多尿等常規(guī)生理狀態(tài)的變化出現(xiàn)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)取NIDDN模型小鼠50只，分成5個(gè)小組(每組10只)，將其分成：模型空白對(duì)照組(DC組)、FASS劑量組(FASSL組)、FASS高劑量組(FASSH組)、二甲雙胍緩釋片(M組)以及正常的健康普通的Balb/C小鼠作為空白對(duì)照組(NC組)。NC組和DC組每天灌胃500 μl dH2O，F(xiàn)ASSL組每天灌胃100 mg/kg的短梗五加莖黃酮，F(xiàn)ASSH組每天灌胃300 mg/kg的短梗五加莖黃酮，M組每天灌胃500 μl含有5 mg/kg的二甲雙胍緩釋片。按照《中藥藥理研究方法學(xué)》關(guān)于人與小鼠體表面積計(jì)算獲得飼喂量對(duì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組連續(xù)灌胃24 d，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，共計(jì)150只小鼠。

2.4 小鼠生理生化指標(biāo)的檢測(cè)：五組小鼠分別在未灌胃、灌胃6 d、灌胃12 d、灌胃18 d和灌胃24 d，5個(gè)階段進(jìn)行空腹尾部靜脈采血，利用血糖儀測(cè)定血糖值，檢測(cè)3次血糖值并記錄。當(dāng)?shù)?5天時(shí)，對(duì)五組小鼠進(jìn)行體質(zhì)量測(cè)定并記錄，然后進(jìn)行活體眼眶取血，再進(jìn)行頸部脫勁處死，按照各個(gè)生理生化指標(biāo)試劑盒檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量，重復(fù)檢測(cè)3次并記錄。

2.5 短梗五加莖黃酮對(duì)小鼠相關(guān)基因表達(dá)的影響：提取小鼠肝臟的總RNA，并利用試劑盒合成小鼠肝臟cDNA，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。根?jù)NCBI查詢2型糖尿病的候選基因：胰島素受體(Insulin receptor-related receptor，INSRR)、肝細(xì)胞核因子(Hepatocyte nuclear factor-1-alpha，HNF1A)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子10(Glucose transporter 2，GLUT10)的序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，見(jiàn)表1。再利用熒光定量PCR檢測(cè)這3個(gè)基因在小鼠肝臟中的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。最后利用SDS 2.3軟件對(duì)測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并計(jì)算2-ΔΔCT，獲得3個(gè)基因的表達(dá)情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量方法以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，采用t檢驗(yàn)，多組間的差異分別采用的是ANOVA單因素方差分析。當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 小鼠中2型糖尿病的候選基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

結(jié) 果

1 灌胃前后小鼠生理狀態(tài)的觀察與體質(zhì)量的測(cè)定 對(duì)灌胃前后五組小鼠進(jìn)行生理狀態(tài)觀察，在連續(xù)灌胃24 d后，NC組小鼠生理狀態(tài)良好，表現(xiàn)為小鼠的飲食和飲水量正常，反應(yīng)靈敏。DC組小鼠生理狀態(tài)出現(xiàn)了明顯變化，主要表現(xiàn)為小鼠的飲食和飲水量相對(duì)增大，其排尿量也出現(xiàn)增多并出現(xiàn)腹瀉糞便稀的狀態(tài)，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍。FASSL組、FASSH組以及M組小鼠生理狀態(tài)也出現(xiàn)了與DC組小鼠類似的變化，但是表現(xiàn)程度相比DC組輕一些。

由圖1可知，短梗五加莖黃酮對(duì)五組小鼠體質(zhì)量的影響。當(dāng)建模前時(shí)，五組小鼠的體質(zhì)量之間不存在差異(P>0.05)；當(dāng)建模后灌胃前時(shí)，DC組、FASSL組、FASSH組和M組這四組小鼠與NC組相比，小鼠的體質(zhì)量之間均存在顯著增加差異(P<0.05)；當(dāng)建模后灌胃后時(shí)，F(xiàn)ASSL組、FASSH組和M組這三組小鼠與DC組相比，小鼠的體質(zhì)量之間均存在顯著降低差異(P<0.05)。因此，從上述結(jié)果可以確定：短梗五加莖黃酮可以控制2型糖尿病(NIDDM)模型小鼠的體質(zhì)量的增長(zhǎng)。

A：表示各組與正常對(duì)照組(NC組)相比，體質(zhì)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；B：表示各組與模型對(duì)照組(DC組)相比，體質(zhì)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)

圖1 短梗五加莖黃酮對(duì)五組小鼠體質(zhì)量的影響

2 短梗五加黃酮對(duì)2型糖尿病模型小鼠血糖的影響 見(jiàn)表2。由表2可知，五組小鼠在未灌胃時(shí)，除正常對(duì)照組(NC組)以外，其他四組小鼠的血糖值不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；在灌胃6 d時(shí)，F(xiàn)ASSH組和M組的小鼠血糖值與DC組相比，存在明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；在灌胃12 d時(shí)，F(xiàn)ASSL組、FASSH組和M組的小鼠血糖值與DC組相比，存在明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；在灌胃18 d時(shí)，F(xiàn)ASSL組、FASSH組和M組的小鼠血糖值變化與灌胃14 d時(shí)變化趨勢(shì)相同；在灌胃24 d時(shí)，F(xiàn)ASSH組和M組與正常空白對(duì)照組(NC組)的小鼠血糖值相比，不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。因此，通過(guò)小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)明，短梗五加莖黃酮可以有效的降低2型糖尿病模型小鼠血糖，從而改善小鼠高血糖病癥。

3 短梗五加黃酮對(duì)2型糖尿病模型小鼠血脂的影響 由圖2可知，隨著灌胃到達(dá)24 d，F(xiàn)ASSL組中TC和TG含量水平、FASSH組中TC和TG含量水平以及M組中TC、TG和LDL-C含量水平，與NC組小鼠的三個(gè)指標(biāo)的含量水平相比，均存在著上升趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；FASSL組、FASSH組以及M組中TC、TG和LDL-C含量水平，與DC組小鼠的三種指標(biāo)的含量水平相比，均存在著降低趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。因此，通過(guò)小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)明，短梗五加莖黃酮可以有效的降低2型糖尿病模型小鼠血脂，從而調(diào)節(jié)小鼠血脂代謝紊亂狀態(tài)。

A：表示各組與正常對(duì)照組(NC組)相比，血脂含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；B：表示各組與模型對(duì)照組(DC組)相比，血脂含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)

圖2 短梗五加莖黃酮對(duì)五組小鼠血脂的影響

4 短梗五加莖黃酮對(duì)小鼠相關(guān)基因表達(dá)的影響 由圖3可知，熒光定量PCR數(shù)據(jù)表明：在FASSL組、FASSH組和M組中影響2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的表達(dá)與兩個(gè)對(duì)照組相比都存在著顯著提高，從而可以在基因表達(dá)層面上解釋，短梗五加莖黃酮對(duì)小鼠灌胃處理后，可以顯著促進(jìn)糖尿病相關(guān)基因的表達(dá)，通過(guò)提高相關(guān)基因的表達(dá)使得小鼠血糖濃度降低，因此短梗五加莖黃酮可以調(diào)控2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)血糖濃度。

表2 短梗五加莖黃酮對(duì)五組小鼠血糖的影響(mmol/L)

注：各組與正常對(duì)照組(NC組)相比，*P<0.05；各組與模型對(duì)照組(DC組)相比，#P<0.05

A：表示各組與正常對(duì)照組(NC組)相比，基因表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；B：表示各組與模型對(duì)照組(DC組)相比，基因表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)

圖3 短梗五加莖黃酮對(duì)小鼠相關(guān)基因表達(dá)的影響

討論

短梗五加與人參均為五加科植物，已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注， 天然的食藥性中藥植物已經(jīng)成為目前世界研究的活性成分分析的熱潮。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者在五加屬植物的生物學(xué)、化學(xué)、藥理學(xué)、基因組學(xué)等方面研究取得了一定的成果[12]，這不僅為短梗五加莖開(kāi)發(fā)利用及食藥性保健品的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，更為中藥現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)化打下了堅(jiān)實(shí)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理主要是為胰島素抵抗(IR)和胰島素分泌缺陷而非胰島B細(xì)胞自身免疫破壞，而高血糖是2型糖尿病的主要病癥之一[10-11]。控制體內(nèi)高血糖是減少和控制2型糖尿病以及其并發(fā)癥的主要辦法之一[12-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短梗五加莖黃酮能夠有效的降低2型糖尿病模型小鼠的病癥，短梗五加莖黃酮高劑量組(FASSH組)具有較好的降低血糖的療效，其效果與二甲雙胍緩釋片的效果相接近。已經(jīng)有研究表明黃酮類化合物可以促進(jìn)肝臟中外源葡萄糖的利用，從而具有降低血糖的作用，而本實(shí)驗(yàn)可以推斷短梗五加莖黃酮能夠有效的降低血糖水平，可能是通過(guò)促進(jìn)利用外源葡萄糖的雙向調(diào)節(jié)利用，或者是短梗五加莖黃酮可以從某種程度刺激胰島素分泌降低血糖。同時(shí)，我們利用了熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了短梗五加莖黃酮，可以促進(jìn)2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的表達(dá)，從而從基因表達(dá)調(diào)控角度研究短梗五加莖黃酮調(diào)控血糖的機(jī)制，但是本研究還處于初步研究，有待于日后進(jìn)一步深入的研究。

短梗五加莖黃酮可以控制2型糖尿病(NIDDM)模型小鼠的體質(zhì)量的增長(zhǎng)，也可以有效的降低2型糖尿病模型小鼠的血糖和血脂，同時(shí)還可以調(diào)控小鼠中相關(guān)2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的上調(diào)表達(dá)，從而調(diào)節(jié)血糖濃度，這不僅改善高血糖病癥和緩解血脂代謝紊亂的問(wèn)題提供了研究基礎(chǔ)，更為日后醫(yī)藥研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。