時(shí)延朋 楊汝春? 張華琴 萬(wàn)鳳

腎小球足細(xì)胞是一種高度分化的上皮細(xì)胞，與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜共同構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障，在外界各種損傷因素刺激下，足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，腎小球?yàn)V過(guò)屏障遭受破壞，從而引發(fā)蛋白尿［1-2］，若不及時(shí)治療則會(huì)導(dǎo)致腎小球硬化，最終導(dǎo)致腎臟衰竭。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-beta，TGF-β1）是一種誘導(dǎo)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞因子，也是引起腎臟纖維化、腎小球硬化的主要誘導(dǎo)因子之一［3］。整合素連接激酶（ILK）與增殖細(xì)胞核蛋白（PCNA）在正常腎組織中表達(dá)水平均較低，而在腎小球足細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)分化時(shí)則表達(dá)上調(diào)。2016年6月至2017年12月作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究探討，沉默信息調(diào)控因子1（Silent information regulator 1，SIRT1）對(duì)腎小球足細(xì)胞表型的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主 要 試 劑 RPMI1640（GIBCO）， 胎 牛 血 清（GIBCO），重組鼠干擾素γ（Recombinant Murine interferon-γ，γ-IFN，美國(guó)Peprotech Inc，315-05），Recombinant Human TGF-β1（ 美 國(guó) Peprotech Inc，100-21），SRT1720（Selleck，016025），兔抗 α-SMA（EPIC MICS，YH090708D），ILK（Santa-Cruz，sc-20019），PCNA（Santa-Cruz，sc-56），鼠抗 GAPDH（達(dá)文生物，DW880543），IR Dye 800CW Goat Anti-Rabbit（C60107-06）；IR Dye 680LT Goat Anti-mouse（C51007-05），CCK-8（Dojindo，CK04）。

1.2 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)及分化：永生化溫度敏感小鼠足細(xì)胞株由Mundel教授惠贈(zèng)，浙江省兒童醫(yī)院毛建華教授轉(zhuǎn)贈(zèng)。將復(fù)蘇的足細(xì)胞用含有γ-干擾素（γ-IFN）100U/ml和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置33℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，讓細(xì)胞增殖傳代。誘導(dǎo)分化時(shí)，將培養(yǎng)液換成不含γ-IFN的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)移至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。（2）細(xì)胞分組：將分化成熟的足細(xì)胞分為正常組、模型組、白藜蘆醇組（5μM）和SRT1720-2μM、SRT1720-1μM組。細(xì)胞干預(yù)前換含2%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，模型組用2ng/ml的TGF-β1刺激72h，白藜蘆醇組和SRT1720-2μM組、SRT1720-1μM組分別先加白藜蘆醇至5μM、SRT1720至2μM和1μM干預(yù)30min，然后用2ng/mlTGF-β1刺激72h。（3）Western-blot技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)豐度：去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液，收集樣本，低溫離心，取上清液，用BCA法測(cè)蛋白濃度。取蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗，4℃過(guò)夜；去一抗，PBST緩沖液洗3次，再加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫孵育1.5h；PBST緩沖液洗6次，通過(guò)Odyssey CLx近紅外雙色熒光成像系統(tǒng)顯影并分析結(jié)果。（4）CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率：將足細(xì)胞以2000個(gè)/孔接種于96孔板，按照實(shí)驗(yàn)分組給予不同藥物作用，培養(yǎng)72h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（±s）表示，多組間采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對(duì)足細(xì)胞存活率的影響 TGF-β1各劑量組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 TGF-β1對(duì)足細(xì)胞存活率的影響（±s）

表1 TGF-β1對(duì)足細(xì)胞存活率的影響（±s）

組別 n 存活率（%）正常組 5 100.0±2.7 TGF-β1（2ng/ml）組 5 104.2±10.0 TGF-β1（5ng/ml）組 5 98.3±8.0 TGF-β1（10ng/ml）組 5 94.3±6.3

2.2 白藜蘆醇和SRT1720對(duì)足細(xì)胞存活率的影響 白藜蘆醇組和SRT1720各劑量組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 白藜蘆醇和SRT1720對(duì)足細(xì)胞存活率的影響

2.3 白藜蘆醇和SRT1720對(duì)TGF-β1刺激的足細(xì)胞存活率的影響 除正常組外，其余各組用TGF-β1刺激，經(jīng)白藜蘆醇和SRT1720干預(yù)后足細(xì)胞存活率降低，且與TGF-β1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SRT1720-2μM和SRT1720-1μM組降低更加明顯。見(jiàn)表3。

2.4 白藜蘆醇和SRT1720對(duì)TGF-β1刺激的足細(xì)胞PCNA的影響 足細(xì)胞經(jīng)TGF-β1刺激后PCNA蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而白藜蘆醇和SRT1720干預(yù)則能夠逆轉(zhuǎn)上述變化，使足細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4、圖 1。

表4 白藜蘆醇和SRT1720對(duì)TGF-β1刺激的足細(xì)胞PCNA的影響

圖1 各組PCNA/GAPDH比較

2.5 白藜蘆醇和SRT1720對(duì)TGF-β1刺激的足細(xì)胞ILK的影響 與正常組比較，TGF-β1組足細(xì)胞ILK蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；經(jīng)白藜蘆醇和SRT1720干預(yù)后足細(xì)胞ILK蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。見(jiàn)表5、圖2。

表5 白藜蘆醇和SRT1720對(duì)TGF-β1刺激的足細(xì)胞ILK的影響

圖2 各組ILK/GAPDH比較

2.6 白藜蘆醇和SRT1720對(duì)TGF-β1刺激的足細(xì)胞α-SMA的影響 正常足細(xì)胞在TGF-β1刺激后α-SMA蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），白藜蘆醇和SRT1720干預(yù)后α-SMA蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表 6、圖 3。

表6 白藜蘆醇和SRT1720對(duì)TGF-β1刺激的足細(xì)胞α-SMA的影響

圖3 各組α-SMA/GAPDH比較

3 討論

腎小球足細(xì)胞位于腎小球基底膜的外側(cè)，由胞體、主突、足突組成，是構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分。TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，能夠誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），導(dǎo)致細(xì)胞表型發(fā)生改變［2，4］，腎小球?yàn)V過(guò)屏障遭到破壞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)足細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，存活率有所增加，可能與足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化以后，細(xì)胞表型改變，產(chǎn)生新的亞型，導(dǎo)致其異常增殖有關(guān)。經(jīng)白藜蘆醇和SRT1720干預(yù)后，足細(xì)胞存活率下降，推測(cè)因SIRT1被激活，從而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，細(xì)胞異常增殖情況得到改善。

ILK是一種新發(fā)現(xiàn)的粘附蛋白，具有多種生物學(xué)活性，為間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，與足細(xì)胞表型改變密切相關(guān)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、基質(zhì)積聚、腫瘤發(fā)生［5-6］、維持腎小球基底膜的完整性、保持腎小球的濾過(guò)功能和防止蛋白質(zhì)的漏出中起重要作用［7］。PCNA又稱周期蛋白（cyclin），是一種僅在增殖狀態(tài)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)的非組蛋白型核蛋白質(zhì)［8］，其在成年大、小鼠腎小管、集合管和腎小球中有少量細(xì)胞表達(dá)［9-10］。研究表明PCNA在增殖細(xì)胞中的含量變化有明顯的周期性，可反映細(xì)胞增殖活性、判斷細(xì)胞增殖狀況，是細(xì)胞增殖程度的可靠指標(biāo)［11］。本資料顯示，當(dāng)足細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，ILK和PCNA蛋白的表達(dá)顯著升高，且間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)也上調(diào)，提示TGF-β1成功誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，足細(xì)胞已失去原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，細(xì)胞異常增殖活性升高。

白藜蘆醇和SRT1720是公認(rèn)的SIRT1激活劑，且SRT1720的激動(dòng)效果比白藜蘆醇強(qiáng)1000倍［12］。研究顯示，白藜蘆醇和SRT1720能夠減少蛋白尿和足細(xì)胞損傷，具有明顯的腎臟保護(hù)作用［13-14］。本資料中，白藜蘆醇和不同劑量的SRT1720對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞干預(yù)后，ILK和PCNA蛋白表達(dá)顯著降低，且對(duì)SRT1720具有劑量依賴性，同時(shí)白藜蘆醇和SRT1720還可降低間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)，這表明SIRT1激活劑能夠顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，降低細(xì)胞的異常增殖，對(duì)腎小球足細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。且5μM白藜蘆醇和1-2μM SRT1720對(duì)足細(xì)胞的存活率無(wú)顯著影響，提示其對(duì)正常足細(xì)胞無(wú)顯著毒副作用。

綜上所述，白藜蘆醇和SRT1720激活SIRT1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化具有顯著抑制作用，SIRT1活化可能是糾正足細(xì)胞病理形態(tài)改變、維持足細(xì)胞正常表型、防治蛋白尿發(fā)生的重要分子靶點(diǎn)。