張晨靜 屠江鋒 耿曉歌 高惠琴 王婧雅 潘文勝?

三陰性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（Her-2）均為陰性的乳腺癌，占全部乳腺癌的10%～20%［1］。其具有惡性程度高、對(duì)化療不敏感、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)體腫瘤中存在一小群具有自我更新能力及多向分化潛能的腫瘤干細(xì)胞，不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且是腫瘤逃避常規(guī)治療手段，導(dǎo)致耐藥復(fù)發(fā)的原因［3］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）是一種多向性、多效性的細(xì)胞因子，以自分泌或旁分泌的方式通過(guò)細(xì)胞表面的受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等調(diào)控［4］。研究表明TGFβ配體及其信號(hào)通路在多能干細(xì)胞的干性維持中發(fā)揮了重要作用［5］。本文探討TGFβ1對(duì)三陰性乳腺癌間質(zhì)樣細(xì)胞表型的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞系SUM159，MDA-MB231及SCP2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱中以37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231，接種于6孔板中，接種密度為1×105細(xì)胞/孔。加入10ng/ml TGFβ1處理24h，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，拍照。

1.3 熒光定量PCR KRT8：上游引物序列為：5'CTAGGTGCGCGGATGGAAAT 3'；下游引物序列為：5'AGGTGGACACCTTGTAGGACT 3'。 KRT18：上游引物序列為：5' GATCATCGAGGACCTGAGGG 3'；下游引物序 列為：5' GTGTCATCAATGACCTTGCGG 3'。ACTA2： 上 游 引 物 序 列 為 ：5'TCGCATCAAGGCCCAAGAAA 3'；下游引物序列為：5'TTGTCACACACCAAGGCAGT 3'。KRT14：上游引物序列為：5' AGAACCTCAATGACCGCCTG 3'；下游引物序列 為 ：5' GTCCACTGTGGCTGTGAGAA 3'。GAPDH：上游引物序列為：5' TGGCCAAGGTCATCCATGAC 3'；下游引物 序列為：5' TGTCATACCAGGAAATGAGCTTG 3'。采用SsoFast? EvaGreen? Supermix（美國(guó)Bio-rad公司）染料法行RT-PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，校正每個(gè)樣本的Ct，計(jì)算△ct值，以2-△△ct計(jì)算基因表達(dá)。

1.4 Western-blot MDA細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Pierce公司）測(cè)定蛋白濃度后，取30g樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，應(yīng)用電轉(zhuǎn)儀將樣品轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉60min，加入小鼠抗人 CyclinD1單克隆抗體一抗（1：1000，美國(guó)abcam公司）。4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)的羊抗小鼠IgG二抗（1：5000）室溫孵育120min，洗膜后化學(xué)發(fā)光 ECL法（美國(guó)Millipore公司）顯影，暗室曝光。以小鼠抗人β-actin（1：5000，美國(guó)CST公司）作為內(nèi)參陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)裸鼠由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌性，3～4周，SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)。取2×106乳腺癌與Matrigel（BD公司）混合懸液注射至裸鼠第二對(duì)乳房墊中，建立乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型。4～5周左右處死小鼠，取出小鼠肝臟，肉眼觀察乳腺癌白色轉(zhuǎn)移灶，后取部分肝臟組織用10%多聚甲醛固定。

1.6 HE染色 肝臟組織經(jīng)過(guò)多聚甲醛固定24h后，脫水、石蠟包埋、切片、組織脫蠟，蘇木素染液染核4 min，浸入自來(lái)水中1 min，0.5%鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗1min，0.5%氨水返藍(lán)，自來(lái)水沖洗1min，伊紅胞漿染色1min，蒸餾水洗1min，乙醇脫水，二甲苯I透明 10min，二甲苯II透明 10min，用中性樹(shù)膠封片。

1.7 免疫組化染色 石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)，血清封閉置于37℃孵育30min，分別于小鼠抗人CyclinD1單克隆抗體一抗，兔抗人CDK4單克隆抗體一抗及兔抗人RB單克隆抗體一抗（美國(guó)abcam公司）4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，二抗37℃孵育30min，PBS洗3次，加SABC后37℃孵育30min，PBS洗3次后加入顯色劑，將顯色后的片子置于水中沖洗后，浸于蘇木精中染色30s，脫水，封片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGFβ1促使三陰性乳腺癌間質(zhì)樣干細(xì)胞表型改變情況 TGFβ1使細(xì)胞進(jìn)一步呈現(xiàn)長(zhǎng)梭樣改變（見(jiàn)圖1A）。伴隨著細(xì)胞形態(tài)的改變，乳腺癌腺導(dǎo)管上皮標(biāo)志物 KRT8 及 KRT18 表達(dá)下降，而間質(zhì)/肌上皮標(biāo)志物 KRT14 及 ACTA2 表達(dá)上調(diào)（見(jiàn)圖1B）。同時(shí)，western-blot研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1組SUM159中干性轉(zhuǎn)錄因子NANOG表達(dá)上調(diào)（見(jiàn)圖1C），提示 TGFβ1促進(jìn)三陰性乳腺癌間質(zhì)樣干細(xì)胞表型進(jìn)一步發(fā)生改變。

2.2 TGFβ1通過(guò)上調(diào)cyclinD1/CDK4通路促進(jìn)三陰性乳腺癌間質(zhì)樣改變 經(jīng)過(guò)TGFβ1處理24h后，三陰性乳腺癌細(xì)胞SUM159中cyclinD1、CDK4、RB表達(dá)上調(diào)（見(jiàn)圖2A）。RT-PCR 對(duì)乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物分析發(fā)現(xiàn)，TGFβ1可以提高 KRT14 及 ACTA2 的表達(dá)，而降低 KRT8及KRT18基因的表達(dá)。而加入CDK4 抑制劑后這種作用被阻斷（見(jiàn)圖2B），提示cyclinD1/CDK4通路為T(mén)GFβ1促進(jìn)并維持三陰性乳腺癌間質(zhì)樣干細(xì)胞表型所必須。

圖1 TGFβ1促使三陰性乳腺癌間質(zhì)樣干細(xì)胞表型情況

A：western-blot檢測(cè)對(duì)照組（ctrl）及TGFβ1組（TGFβ1）cyclinD1、CDK4、RB及內(nèi)參表達(dá)；B：RT-PCR對(duì)乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物分析

2.3 TGFβ1誘導(dǎo)的乳腺癌間質(zhì)樣干細(xì)胞表型促進(jìn)裸鼠乳腺癌肝臟轉(zhuǎn)移 為進(jìn)一步研究TGFβ1誘導(dǎo)的乳腺癌間質(zhì)樣干細(xì)胞表型在裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移中的作用，將對(duì)照組及經(jīng)過(guò)TGFβ1反復(fù)處理的乳腺癌MDA細(xì)胞注射到裸鼠第二對(duì)乳房墊中，建立乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型。4～5周左右處死小鼠，取出小鼠肝臟，并觀察乳腺癌白色轉(zhuǎn)移灶。結(jié)果顯示，與接種對(duì)照組MDA細(xì)胞（Ctrl）的裸鼠相比，接種TGFβ1反復(fù)處理組MDA細(xì)胞（TGFβ1）的裸鼠乳腺癌肝臟轉(zhuǎn)移灶顯著增加（見(jiàn)圖3A）。圖3B顯示為乳腺癌肝轉(zhuǎn)移灶HE染色。免疫組化顯示TGFβ1反復(fù)處理組乳腺癌肝臟轉(zhuǎn)移灶中cyclinD1表達(dá)上調(diào)（見(jiàn)圖3C）。

圖3 TGFβ1誘導(dǎo)的乳腺癌間質(zhì)樣干細(xì)胞表型促進(jìn)裸鼠乳腺癌肝臟轉(zhuǎn)移

3 討論

三陰性乳腺癌占所有乳腺癌類型的10%，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌中富含腫瘤干細(xì)胞，對(duì)傳統(tǒng)放化療不敏感，預(yù)后差，因此受到了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。前期研究發(fā)現(xiàn)，三種乳腺癌細(xì)胞SUM159、MDA及SCP2中CD44+CD24-含量較高，而CD44+CD24-干細(xì)胞多分布于侵襲性腫瘤邊緣，具有間質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài)，與細(xì)胞的局部侵襲乃至轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6］。近期研究表明TGFβ1配體及其信號(hào)通路在多能干細(xì)胞的干性維持中發(fā)揮重要作用。

為了進(jìn)一步研究TGFβ1對(duì)乳腺癌間質(zhì)樣細(xì)胞表型的作用及其機(jī)制，在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用TGFβ1 反復(fù)處理三種乳腺癌細(xì)胞SUM159、MDA及SCP2，并觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGFβ1促使三陰性乳腺癌細(xì)胞進(jìn)一步間質(zhì)樣改變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TGFβ1通過(guò)上調(diào)cyclinD1/CDK4促進(jìn)三陰性乳腺癌間質(zhì)樣改變。細(xì)胞周期素D1（cyclinD1）屬于細(xì)胞周期正調(diào)控因子，研究發(fā)現(xiàn)cyclinD1在多種腫瘤中存在擴(kuò)增及過(guò)度表達(dá)的現(xiàn)象，cyclinD1的過(guò)度表達(dá)常導(dǎo)致CDK4對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感因子（Rb）的調(diào)節(jié)障礙，使其處于持續(xù)磷酸化狀態(tài)，釋放大量的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子E2F，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖［7-8］。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cyclinD1/CDK4通路在TGFβ1誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌間質(zhì)樣干細(xì)胞表型變化中也發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)在乳腺癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型中進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，TGFβ1誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌間質(zhì)樣改變促進(jìn)了乳腺癌肝臟轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量，免疫組化染色進(jìn)一步驗(yàn)證了TGFβ1預(yù)處理組裸鼠肝轉(zhuǎn)移灶中cyclinD1陽(yáng)性染色增加。這些結(jié)果提示TGFβ1通過(guò)上調(diào)cyclinD1/CDK4通路促進(jìn)三陰性乳腺癌間質(zhì)樣干細(xì)胞表型改變。同時(shí)，TGFβ1誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌間質(zhì)樣干細(xì)胞表型改變促進(jìn)了裸鼠乳腺癌肝臟轉(zhuǎn)移。