王黎穎，楊國蘭，田甜，閆爽，戴朝玲，徐仰倉，*

（1.天津市海洋環(huán)境保護與修復技術工程中心，天津300457；2.天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津300457；3.天津聯創(chuàng)環(huán)境保護監(jiān)測有限公司，天津301800）

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）是一種耐鹽堿的單細胞綠藻，在海洋、鹽湖等環(huán)境下廣泛分布。因杜氏鹽藻生長在惡劣的環(huán)境中，藻體內積累了一些特殊的生理活性物質，如β-胡蘿卜素、甘油、?；撬帷⒍嗖伙柡椭舅岬萚1-2]。目前，杜氏鹽藻已應用于食品、保健品及化妝品等行業(yè)[3]。然而，杜氏鹽藻特有的腥味卻在一定程度上限制了產品的深度開發(fā)及應用。目前，對于藻類脫腥技術的研究重點在大型海藻，如江蘺、海帶、裙帶菜、紫菜等[4-8]，國內外關于微藻的脫腥技術和揮發(fā)性氣味的研究也僅限于螺旋藻、硅藻等[9-12]，杜氏鹽藻的脫腥技術研究鮮見報道。本文研究了茉莉花茶脫除杜氏鹽藻腥味的條件，并檢測了脫腥前后腥味物質及β-胡蘿卜素含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）藻粉：無棣綠奇生物工程有限公司；茉莉花茶：市售；β-胡蘿卜素標準品：德國CNW科技公司（CNW Technologies GmbH）；杜氏鹽藻浸膏：天津天光公司；95%乙醇（分析純）：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；甲醇（色譜純）：天津市康科德科技有限公司；乙腈（色譜純）：北京化工廠；三氯甲烷（分析純）：上海沃凱生物技術有限公司；石油醚（色譜純）：天津市光復精細化工研究所。

GC-MS-4000氣相色譜-質譜聯用儀：美國VARIAN公司；手動SPME進樣器：美國SUPELCO公司；SPME萃取頭：上海安譜科學儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 杜氏鹽藻的脫腥

脫腥的工藝流程：稱取杜氏鹽藻藻粉→加水溶解→杜氏鹽藻脫腥→進行感官評價→頂空固相微萃取與氣質連用相結合（headspace-solid phase microex traction-gas chromatography-mass spectrum，HS-SPMEGC-MS）驗證脫腥效果。

1.2.1.1 溫度對脫腥效果影響

取6個250 mL潔凈干燥的錐形瓶，分別裝入4 g杜氏鹽藻藻粉，再加入100 mL蒸餾水，攪拌均勻，分別在 10、20、30、40、50、60、70、80℃溫度下水浴加熱 30min，冷卻后感官評定各組的腥味程度。

1.2.1.2 水浴時間對脫腥效果影響

將茉莉花茶與鹽藻粉按50∶1（mg/g）的比例混合，然后置于40℃的水浴中。改變水浴時間，測定水浴時間在0 min～90 min內茉莉花茶的脫腥效果。

1.2.1.3 茉莉花茶與鹽藻粉的配比對脫腥效果影響

配制茉莉花茶與鹽藻粉的比例分別為0、12.5∶1、25 ∶1、37.5 ∶1、50 ∶1、62.5 ∶1（mg/g）。水浴加熱 30 min左右并持續(xù)攪拌，感官評定其腥味。并將脫腥后的藻溶液冷凍干燥成脫腥藻粉備用。

1.2.2 杜氏鹽藻揮發(fā)性物質相對含量的測定

采用頂空固相微萃取和氣質聯用相結合（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrum，HS-SPME-GC-MS）的方法[13]。將藻粉裝入頂空瓶約1/3高度處，加蓋封口，60℃水浴加熱30 min。將固相微萃取頭在氣相色譜進樣口老化30 min，老化溫度250℃。將老化好的萃取頭插入頂空瓶的頂空部分，60℃條件下萃取30 min。拔出萃取頭，插入設置好的氣質聯用儀進樣口，于250℃下脫吸附2.5 min后進行樣品分析。色譜條件：VF-5ms色譜柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管柱。程序升溫：初始溫度40℃保持3min，以4℃/min升至150℃，保持1min，以8℃/min升至250℃，保持6min。進樣口溫度250℃，分流比：5/1；載氣：He；純度：99.99%；載氣流速：1 mL/min。質譜條件：傳輸線溫度280℃；質量分析器：離子阱；離子阱溫度：220℃；掃描方式：full/SIS；掃描范圍：43 m/z～500 m/z。通過NIST05譜圖庫對氣質聯用（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）檢測的揮發(fā)性成分進行解析，再經過人工譜圖解析，確定其化學成分；利用譜圖庫數據處理系統(tǒng)按峰面積歸一化法進行定量分析，得出各化學成分在揮發(fā)性物質中的相對含量。

1.2.3 感官評定[14]

脫腥效果的評定通過經典的嗅覺感官評定。因脫腥效果無法定量測定，在單因子脫腥試驗中招募健康無感冒癥狀且年齡在18歲～25歲之間的志愿者10人，在清凈無其它異味的房間試驗以腥味大小評價脫腥效果好壞，將樣品放在鼻孔下方10 cm處，嗅其腥味并打分。無腥味為100分，腥味越重，分數越低。去掉最高分和最低分，求剩余8位的平均分。

1.2.4 β-胡蘿卜素含量的測定

藻粉中的β-胡蘿卜素采用高效液相色譜法測定[15-16]，色譜儀為Shimadzu LC-20A；色譜柱類型是HypersiL ODS，5 μm，250 mm × 4.0 mm；流動相乙腈與甲醇體積比為15∶85；流速是1.2 mL/min；檢測波長為448 nm；進樣量為 10 μL。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下茉莉花茶的脫腥效果

將茉莉花茶與鹽藻粉按50∶1（mg/g）的比例混合，然后置于不同溫度的水浴中30 min。結果發(fā)現溫度在40℃以下脫腥效果隨溫度升高緩慢增加，溫度超過40℃脫腥效果快速下降（見圖1）。

圖1 不同溫度下茉莉花茶的脫腥效果Fig.1 The effect of dislocation of jasmine tea at different temperatures

如圖1所示，茉莉花茶的最佳脫腥溫度是40℃。腥味物質是一些次生代謝產物或加工過程中產生的物質，溫度越高，釋放的揮發(fā)性腥味物質越多。脫腥劑脫出腥味的機理可能是通過化學反應抑制腥味物質的釋放或者分解腥味物質，或者是脫腥劑釋放香味、甜味等氣味遮蔽腥味[10-13]。40℃以下茉莉花茶的脫腥效果隨溫度升高而增加，說明此階段茉莉花茶對腥味的消除強于杜氏鹽藻釋放的腥味，而40℃之后，茉莉花茶的脫腥效果急劇減弱，說明此階段杜氏鹽藻釋放的腥味不能很好的被茉莉花茶消除。

2.2 不同水浴時間下茉莉花茶脫腥的效果

將茉莉花茶與鹽藻粉按50∶1（mg/g）的比例混合，然后置于40℃的水浴中。改變水浴時間，測定不同作用時間下茉莉花茶的脫腥效果見圖2。

如圖2所示，起初隨著水浴時間的延長，感官評價分數逐漸增高，30 min之后，感官分數又逐漸降低。說明水浴時間過長，茉莉花自身的有效成分不能遮蔽杜氏鹽藻的腥味，腥味物質的大量釋放從而導致感官分數下降。

圖2 不同水浴時間下茉莉花茶的脫腥效果Fig.2 The deodorization effect of jasmine tea under different water bath time

2.3 茉莉花茶與鹽藻粉的不同配比對脫除杜氏鹽藻粉腥味的效果

茉莉花茶與鹽藻粉不同配比對脫除杜氏鹽藻粉腥味效果見圖3。

圖3 茉莉花茶與鹽藻粉不同配比的脫腥效果Fig.3 The dislocation effect of different ratios of jasmine tea and salt algae powder

隨著茉莉花茶濃度的增大，杜氏鹽藻溶液的腥味逐漸降低，當茉莉花茶與杜氏鹽藻粉濃度之比達到50∶1（mg/g）時，藻溶液的感官分數達到76。此后二者的濃度比雖有增加，但感官分數的增加卻沒有統(tǒng)計學意義。另外，當茉莉花茶/杜氏鹽藻增為62.5∶1（mg/g）時，藻溶液略帶苦味，表明茉莉花茶的風味已改變了杜氏鹽藻本來的風味。因此，茉莉花茶與杜氏鹽藻粉的最佳比例為 50 ∶1（mg/g）。

綜上研究結果，茉莉花茶的最佳脫腥條件為：茶/藻=50∶1（mg/g）的比例混合茶和藻，然后將混合物置于40℃水浴中攪拌30 min。

2.4 杜氏鹽藻脫醒前后主要揮發(fā)性物質的變化

從感官評價分數看，茉莉花茶具有脫除杜氏鹽藻粉腥味的功能。但感官評價有一定的主觀性，為此用HS-SPME-GC-MS法分析了脫腥前后腥味物質的變化。圖4是杜氏鹽藻脫腥前后的GC-MS總離子流圖。

圖4 杜氏鹽藻揮發(fā)性物質GC-MS總離子流圖Fig.4 The GC-MS total ion chromatography of volatile compounds in Dunaliella salina

對總離子流圖進行解析，得到脫腥前后揮發(fā)性腥味物質的主要種類及相對含量（見表1）。

表1 脫腥前后杜氏鹽藻粉主要揮發(fā)性腥味物質及其含量的變化Table 1 Changes of main volatile odour compounds and their content in Dunaliella salina powder before and after deodorization

由表1可知，未被茉莉花茶處理時杜氏鹽藻腥味物質占總揮發(fā)性物質的18.532%，茉莉花茶處理后，腥味物質總含量降低了37.5%。脫腥后2-茨醇和異佛爾酮含量分別降低了100%和13.3%，2-茨醇是含量最高的揮發(fā)性腥味物質，本身具有樟腦的氣味。研究表明，2-茨醇是二甲基異莰醇的前體物質，后者具有較強的泥土味和土臭味[17]。異佛爾酮是杜氏鹽藻中含量較高的另一種揮發(fā)性物質，異氟爾酮也是β-胡蘿卜素的降解產物[18]，該物質具有樟腦味和土腥味[19]，能刺激流淚。這兩種化合物占總揮發(fā)性物質的9.659%，由此得出杜氏鹽藻的主要腥味是樟腦味和土腥味。使用茉莉花茶處理后，有3種腥味物質未檢測到，說明茉莉花茶能抑制腥味物質的釋放。3，5，5-三甲基-3-環(huán)己烯-1-酮是另一種含量較高的酮類揮發(fā)性腥味物質，相關文獻報道該物質是引起魚腥味的重要物質[20]，經茉莉花茶處理后的藻液中該物質的含量降低了42.9%，可見茉莉花茶能減弱杜氏鹽藻的魚腥味。以上結果表明茉莉花茶可去除杜氏鹽藻中的樟腦味、土腥味和魚腥味，是一種較好的脫腥劑。這一結果與感官評價結果一致。

經茉莉花茶處理后的杜氏鹽藻藻粉，出現了一些新的揮發(fā)性化合物（見表1），如植醇，6-甲基-6-（5-甲基呋喃-2-基）庚-2-酮、水楊酸甲酯等。植醇和6-甲基-6-（5-甲基呋喃-2-基）庚-2-酮均具有芳香氣味，水楊酸甲酯是茉莉花茶的揮發(fā)性香氣成分[21]。這些香味化合物的產生，在一定程度上遮蔽了杜氏鹽藻粉的腥臭味，這或許是茉莉花茶去除腥味的另一原因。

2.5 脫腥過程中β-胡蘿卜素含量的變化

β-胡蘿卜素是杜氏鹽藻的標志性化合物，也是衡量藻粉品質的重要指標之一。杜氏鹽藻粉脫腥的過程中，可能會降低其品質。為此，我們用HPLC檢測了脫腥前后β-胡蘿卜素含量的變化，結果見圖5。

圖5 茉莉花茶脫腥對杜氏鹽藻粉β-胡蘿卜素含量的影響Fig.5 The effect of jasmine tea deodorization on β-carotene content in Dunaliella salina

結果表明，用茉莉花茶處理后，杜氏鹽藻粉中的β-胡蘿卜素含量降低了19.57%，而在同樣條件下未經茉莉花茶處理的杜氏鹽藻β-胡蘿卜素含量降低了31.49%，說明茉莉花茶有抑制β-胡蘿卜素分解的功能。β-胡蘿卜素是一個含有多個雙鍵的萜類化合物，極易被光、氧氣、熱氧化[22]。茉莉花茶含有多種酚類物質，具有很強的抗氧化功能。由此推測茉莉花茶中的酚類物質保護了藻粉中的β-胡蘿卜素。

3 結論與討論

本文研究茉莉花茶對杜氏鹽藻腥味的脫除效果，得到茉莉花茶的最佳脫腥條件：茉莉花茶/杜氏鹽藻粉=50∶1（mg/g），40℃水浴中攪拌 30 min。采用頂空固相微萃取與氣質聯用的方法檢測到杜氏鹽藻的主要呈腥物質為：2-茨醇、異佛爾酮、3，5，5-三甲基-3-環(huán)己烯-1-酮、4，4-二甲基-環(huán)己-2-烯-1-醇、2，6-二甲基-5-庚烯醛、2，4，4-三甲基-2-環(huán)己烯-1-醇。它們占總腥味物質的91.6%。茉莉花茶處理后，上述腥味物質含量均下降，其中2-茨醇、4，4-二甲基-環(huán)己-2-烯-1-醇和2，6-二甲基-5-庚烯醛未檢測到，表明茉莉花茶脫除腥味的主要機理是抑制腥味物質的揮發(fā)或產生。經過茉莉花茶處理后產生了一些香味物質如水楊酸甲酯、芐醇等，這些香味物質的產生，也會遮蔽杜氏鹽藻的腥味。由此可得出茉莉花茶通過化學途徑和物理途徑兩種方式來消除杜氏鹽藻的腥味。2-茨醇、異佛爾酮、3，5，5-三甲基-3-環(huán)己烯-1-酮是杜氏鹽藻含量最高的3種腥味物質，具有樟腦味、土腥味和魚腥味，茉莉花茶使其含量降低了65.3%，表明茉莉花茶主要去除了上述3種腥味。β-胡蘿卜素是杜氏鹽藻的重要功能性物質，杜氏鹽藻粉經茉莉花茶處理后，β-胡蘿卜素的損失量減少了。以上試驗表明茉莉花茶不但能去除杜氏鹽藻的腥味，還有助于抑制β-胡蘿卜素的分解。本研究結果為深度開發(fā)利用杜氏鹽藻提供基礎數據。