李 磊，鄭懷亮,寇 玉,張 健,楊海韻

(1.河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院,河南洛陽 471000；2.揚州大學醫(yī)學院,江蘇揚州 225000；3.廣州中醫(yī)藥大學附屬佛山中醫(yī)院 528000)

早期股骨頭壞死的治療多選用保留股骨頭外形的髓芯減壓手術。骨是一個相對密閉的環(huán)境，由骨皮質(zhì)包繞形成，很多種因素都可引起該密閉空間的壓力升高，當骨內(nèi)壓升高時會壓迫骨內(nèi)的血管，阻礙骨內(nèi)微循環(huán)，導致骨微觀結構的血液供應不足[1]。在股骨頭壞死的早期，通過鉆孔減壓使骨內(nèi)密閉環(huán)境開放，打通了骨內(nèi)微循環(huán)，靜脈血的回流增強，骨髓水腫減輕，骨內(nèi)微觀結構空間增加，形成了良性微循環(huán)，改善了宏觀股骨頭頸內(nèi)的血液循環(huán)，創(chuàng)造了促進壞死骨吸收、新骨形成的良好條件。最近，TRAISTARU等[2]開展了一項關于患者的成像和組織病理學方面的相關性的回顧性研究，認為組織病理學是患者精確治療階段中一個關鍵的角色。髓芯減壓目前仍然被認為是一種有爭議的技術[3-4]。有研究通過動脈灌注骨髓干細胞治療新西蘭兔股骨頭壞死，結果顯示：發(fā)生病變的股骨頭內(nèi)血管被骨髓干細胞疏通，骨髓干細胞能夠改善股骨頭壞死區(qū)及周圍組織的血液循環(huán)，促進血管再生。

本研究采用髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞治療早期股骨頭壞死，通過檢測空骨陷窩率、骨小梁面積比、脂肪細胞平均直徑來量化治療效果。探討髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞治療股骨頭壞死的病理變化。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取2只SPF級健康1周大新西蘭白兔(購自南方醫(yī)科大學動物實驗中心)納入本實驗研究，用于提取骨髓間充質(zhì)干細胞，體質(zhì)量0.5～0.8 kg。選取48只SPF級健康成年新西蘭白兔納入本實驗研究，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，采用顆粒飼料單籠飼養(yǎng)。

1.2構建兔股骨頭壞死模型及分組 隨機選取12只新西蘭白兔為空白對照組，其余動物用液氮法構建股骨頭壞死模型。術后2周隨機抽取3只實驗兔，行X線、螺旋CT、HE染色等檢測，證實造模是否成功。造模成功后將造模白兔分為模型組、髓芯減壓組、髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞組，每組各12只。

1.3骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng) 將骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)瓶放入37 ℃，含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)5～7 d，每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)、瓶中培養(yǎng)基色澤并照相,根據(jù)培養(yǎng)基色澤及細胞狀態(tài)決定是否需要換液，一般是48 h后首次換液,吸出培養(yǎng)液,PBS液沖洗2遍,棄去未貼壁細胞,更換新鮮的L-DMEM培養(yǎng)液，一般48～72 h換液1次。

1.4髓芯減壓術及注射干細胞的步驟 取新西蘭白兔稱質(zhì)量后，采用1 mL一次性無菌注射器依次取3%戊巴比妥鈉注射液0.5 mL/kg、速眠新Ⅱ 0.1 mL/kg混合后經(jīng)兔耳后緣外側的耳靜脈注射麻醉，采用右側臥位，以右股骨大轉子為中心，用生理鹽水濕潤毛發(fā)后以彎組織剪緊貼皮膚剪除毛發(fā)，半徑約5 cm，予碘伏消毒皮膚、備皮。常規(guī)無菌操作下，取大轉子下緣約1 cm縱向切口，暴露骨膜，便攜式手提X線機透視下用電轉安裝直徑1 mm的定位針，以大轉子下緣外側為進針點，沿股骨頸中央向股骨頭中心方向轉入，有落空感后繼續(xù)推進，到底后硬化帶低速磨轉，直至尖端達關節(jié)面下約0.5 cm，然后用直徑1 cm空心鉆套入定位針全段擴髓，退出空心鉆，拔出定位克氏針，用骨蠟封口，逐層縫合。注射干細胞時，沿股骨頸中央向股骨頭中心方向轉入，有落空感后繼續(xù)推進，到底后硬化帶低速磨轉，直至尖端達關節(jié)面下約0.5 cm，然后用直徑1 cm空心鉆套入定位針全段擴髓，退出空心鉆，拔出定位針的同時插入5 mL一次性無菌注射器針頭，此時出血較多，取出在-20 ℃下預冷的1 mL一次性無菌注射器和套管針，在4 ℃冰箱里快速吸取骨髓干細胞和基質(zhì)膠混合物，原放置注射器盡量吸干骨髓道里積血后，套管針插至骨髓道最深處緩慢向股骨頭內(nèi)注入干細胞混合物，內(nèi)含成骨細胞約200萬個，去除1 mL注射器后用套管針針芯再次推入防止干細胞殘留在套管針內(nèi)壁，拔除套管針的同時以骨蠟堵塞骨髓道，用骨蠟封口，股骨頭頸倒置位保持10 min至基質(zhì)膠凝固定位，縫合術口。

1.5影像學觀察 實驗動物造模后2周隨機抽取3只，經(jīng)檢測證實股骨頭壞死模型制備成功，分別行單純髓芯減壓術、髓芯減壓+骨髓間充質(zhì)干細胞移植修復術。各組至股骨頭壞死模型制備成功后2、4、8周分別隨機抽取3只實驗兔檢測，方法如下：采用1 mL一次性無菌注射器依次取3%戊巴比妥鈉注射液0.5 mL/kg、速眠新Ⅱ 0.1 mL/kg混合后經(jīng)兔耳后緣外側的耳靜脈注射麻醉，俯臥位放置X線攝像或CT床，保持雙側髓關節(jié)外展,稍后伸,采用耳蝸模式掃描雙側兔髖關節(jié)，采集圖像，了解股骨頭壞死修復情況。

1.6病理學觀察 獲取治療8周的各組實驗動物的股骨頭，置于體積分數(shù)10%甲醛溶液中固定24 h，5%稀硝酸脫鈣3～5 d，系列乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察空骨陷窩率(empty bone lacunae rate，EBLR，每高倍視野空骨陷窩數(shù)與骨細胞數(shù)比值，計數(shù)3個空骨陷窩較多視野，取其平均值)、骨髓脂肪細胞平均直徑及骨小梁面積比等組織學特征。

2 結 果

2.1骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng) 兔原代細胞提取種入帶完全培養(yǎng)基的25 cm培養(yǎng)瓶中，將細胞培養(yǎng)瓶放入37 ℃，含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)4 h，用倒置相差顯微鏡觀察即可發(fā)現(xiàn)圓形的懸浮細胞開始部分聚集，細胞呈梭形，集結于平底(圖1)，隨著時間推移，貼壁生長的細胞數(shù)量逐漸增多，培養(yǎng)7 d后(期間據(jù)培養(yǎng)基色澤及細胞狀態(tài)決定是否需要換液)，貼壁梭形細胞生長融合率達90%以上，沒有或有極少懸浮單個細胞存在。貼壁細胞形態(tài)均一，呈長梭形旋渦狀生長。

圖1 不同時間骨髓間充質(zhì)原代細胞形態(tài)學觀察(×200)

2.2兔股骨頭壞死模型構建結果

2.2.1X線影像學結果 造模后2周左側股骨頭密度明顯增高，但無法辨別鉆孔隧道(圖2)。

圖2 兔髖關節(jié)正位X線片

2.2.2病理學結果 造模后2周隨機選取模型組兔子和空白組兔子各1只行股骨頭病理切片，證實股骨頭壞死模型造模成功(圖3)。空白組：骨小梁排列整齊，無變細，造血組織無減少，空骨陷窩少見；模型組：骨小梁變細、稀疏、部分斷裂，造血組織減少，空骨陷窩增加，脂肪細胞增多。

A：空白組；B:模型組

圖3空白組與模型組病理圖片(HE×100)

2.3各組治療8周后病理學結果 空白組：股骨頭部骨小梁結構、形態(tài)完整，骨小梁中的骨細胞清晰可見，周圍成骨細胞豐富，空骨陷窩少見，骨髓腔內(nèi)造血細胞豐富，形態(tài)正常，脂肪細胞與造血組織比例均勻。模型組：股骨頭部骨小梁變細，間距增大，結構紊亂，部分有斷裂現(xiàn)象，脂肪細胞數(shù)增多，空骨陷窩數(shù)明顯增加。髓芯減壓組：與模型組相比，骨小梁粗大，排列規(guī)則，骨髓腔內(nèi)造血細胞增多，脂肪細胞數(shù)有所減少，骨細胞部分恢復正常，空骨陷窩明顯減少。髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞組：與模型組相比，骨小梁基本恢復正常，排列規(guī)則，骨髓腔內(nèi)造血細胞增多，脂肪細胞數(shù)減少，骨細胞大部分恢復正常，空骨陷窩明顯減少(圖4、表1)。

A:空白組；B：模型組；C：髓芯減壓組；D：髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞組

圖4 不同治療組治療8周后兔股骨頭部病理圖片(HE×100)

2.4骨小梁面積比、空骨陷窩率、脂肪細胞平均直徑 與空白組相比，髓芯減壓組及髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞組骨小梁面積比處于較高水平，髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞組與空白組更為接近，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組骨小梁面積比處于較低水平(25.36%±2.7%)，與空白組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。另外與模型組相比，髓芯減壓組和髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞組骨小梁面積比部分恢復，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞組與空白組細胞中空骨陷窩率均處較低水平(12.8%±2.5%vs. 11.25%±2.1%)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。髓芯減壓組空骨陷窩率有所下降，與空白組相比差異不明顯。與模型組相比，髓芯減壓組和髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞組的空骨陷窩率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與空白組相比，模型組脂肪細胞平均直徑明顯升高(P<0.05)，脂肪細胞平均直徑為(57.7±3.5)μm。髓芯減壓組和髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞組與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

3 討 論

股骨頭壞死是一種骨科常見病，由創(chuàng)傷、激素、乙醇等多種病因所造成。兒童的骨骼發(fā)育尚未成熟，其股骨頭壞死的臨床癥狀及病理生理過程不同，被稱為Perthes病(legg calve perthes disease，LCPD)。近年來，該病發(fā)病率不斷增高，且發(fā)病年齡明顯減小，患者患肢功能嚴重下降。在美國，每年新增20 000～30 000例患者，并且占到全髖置換手術的5%～18%，因而引起越來越多的國內(nèi)外學者重視。

改善股骨頭血供，提高髖關節(jié)功能，延緩壞死股骨頭塌陷，成為治療早期股骨頭壞死的關鍵措施。髓芯減壓術為治療早期股骨頭壞死的微創(chuàng)手術方法之一，臨床效果肯定[5]。但是，治療早期股骨頭壞死有很多種方法，從傳統(tǒng)的髓芯減壓、旋轉截骨術、人工支架到生長因子，這些方法都不能完全保護股骨頭和避免股骨頭崩塌[6]。因此，為了較好修復壞死骨組織，增加股骨頭內(nèi)血運供應，促進新骨形成，在傳統(tǒng)髓芯減壓術基礎上，增加骨髓間充質(zhì)干細胞移植，將能更好地治療早期股骨頭壞死。骨髓間充質(zhì)干細胞移植是近年來研究治療股骨頭壞死方法的熱點，研究認為骨髓干細胞具有多向分化潛能，在特定理化條件和細胞因子的作用下，有向成骨細胞分化的能力，促進骨修復[7]。經(jīng)證實，含有骨髓間充質(zhì)干細胞的骨細胞衍生細胞可提供成骨細胞并促進骨形成[8]。

本研究通過體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞得到較純的干細胞后經(jīng)髓芯減壓聯(lián)合干細胞移植進行治療。本研究通過液氮法進行兔股骨頭壞死模型的造模來進行不同組治療效果的比較，實驗分組為空白組、造模組、髓芯減壓組、髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞組。體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞結果顯示，通過體外培養(yǎng)可見純度90%以上的骨髓間充質(zhì)干細胞，可以用于骨髓間充質(zhì)干細胞的移植。股骨頭壞死病理學研究報道已有較多。早在1973年，ARLET等根據(jù)鏡下病理學表現(xiàn)將股骨頭壞死分為4期：1期為骨髓造血功能消失，被水腫或出血及脂肪細胞所分離，出現(xiàn)泡沫細胞；2期為骨髓內(nèi)脂肪細胞壞死，造血性骨髓變?yōu)轭w粒狀；3期為骨髓和骨小梁完全壞死；4期為骨髓纖維化密集，壞死骨小梁上出現(xiàn)新生骨小梁[9]。本研究結果顯示：與模型組相比，髓芯減壓組有明顯治療效果，表現(xiàn)為骨小梁面積比增加，空骨陷窩率減少，脂肪細胞直徑減少。但與空白組相比還存在明顯差異。髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞組治療效果較髓芯減壓組更為明顯，與空白組更為接近，與空白組相比差異無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，經(jīng)過體外提取及培養(yǎng)可以獲得較高純度的骨髓間充質(zhì)干細胞并用于治療股骨頭壞死。髓芯減壓和髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞對兔股骨頭壞死具有治療作用，而后者治療作用更為明顯。