涂志華，周 知，馬 寧，吳 忠，黎業(yè)娟，王安國(guó)，阮海玲，趙立強(qiáng)，胡嘉嘉，王 潔

(海南省婦幼保健院:1.生殖醫(yī)學(xué)中心;2.檢驗(yàn)中心，?？?570206)

珠蛋白生成障礙性貧血(thalassemia)是由于珠蛋白基因發(fā)生缺失或突變而導(dǎo)致的一組溶血性貧血，可遺傳；以α-珠蛋白生成障礙性貧血和β-珠蛋白生成障礙性貧血為主要類型[1]。α-珠蛋白生成障礙性貧血又根據(jù)其基因改變類型的不同，分為缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血和非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血[2]。地中海沿岸國(guó)家及東南亞各國(guó)、非洲均是珠蛋白生成障礙性貧血高發(fā)區(qū)，就十年前WHO統(tǒng)計(jì)，全世界就有約3.5億人攜帶珠蛋白生成障礙性貧血基因[3]。聚合酶鏈反應(yīng)-反向點(diǎn)雜交法(PCR-RDB)針對(duì)基因突變區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性探針置于尼龍膜等介質(zhì)上，PCR體外擴(kuò)增基因突變DNA片段，同介質(zhì)上的探針雜交并顯色，能夠進(jìn)行多個(gè)靶基因并行檢測(cè)，可用于批量檢測(cè)，是臨床上檢測(cè)非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血的主流方法。中國(guó)珠蛋白生成障礙性貧血人群Hb Westmead(Hb WS)、Hb Quong Sze(Hb QS)、Hb Constant Spring(Hb CS)3種常見(jiàn)非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血大多采用PCR-RDB法檢測(cè)[4]。我國(guó)南方珠蛋白生成障礙性貧血高發(fā)，特別是廣西、廣東、海南，各級(jí)政府每年需支付數(shù)以億計(jì)的群體篩查費(fèi)用。筆者希望可以建立一種針對(duì)珠蛋白生成障礙性貧血群體篩查的方法，基于PCR-RBD技術(shù)，將適量例數(shù)的DNA標(biāo)本混合成1例檢測(cè)的非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因批量檢測(cè)的方法，以縮減珠蛋白生成障礙性貧血群體防控經(jīng)費(fèi)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本處理 取患者靜脈血3 mL，置入抗凝管內(nèi)。采用全血DNA快速提取試劑盒(亞能生物技術(shù)有限公司)，運(yùn)用柱式分離法，提取抗凝血中的DNA。

1.2PCR-RDB 采用非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變檢測(cè)試劑盒(亞能生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行檢測(cè)，儀器采用ABI 9700型PCR儀。嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，每批設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照。檢測(cè)限相關(guān)最大標(biāo)本數(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)抽取臨床標(biāo)本10例，分別稀釋3、6、12倍，經(jīng)PCR-RDB檢測(cè)，觀察結(jié)果。

1.3干擾實(shí)驗(yàn) 驗(yàn)證非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因DNA標(biāo)本之間、與健康人標(biāo)本之間會(huì)否相互干擾檢測(cè)結(jié)果。3種非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血標(biāo)本間干擾實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)選取Hb WS、Hb CS、Hb QS的DNA標(biāo)本各1例，等量混勻，經(jīng)PCR-RDB檢測(cè)后觀察結(jié)果，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血標(biāo)本與正常標(biāo)本間的干擾實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)選取Hb WS、Hb CS、Hb QS兩類標(biāo)本各1例，與正常標(biāo)本1例，等量混勻，經(jīng)PCR-RDB檢測(cè)后觀察結(jié)果，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。健康人標(biāo)本之間的干擾實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)選取健康人DNA標(biāo)本3例，等量混勻，經(jīng)PCR-RDB檢測(cè)后觀察結(jié)果，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4數(shù)學(xué)模型建立 設(shè)某地區(qū)初篩實(shí)驗(yàn)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為K，初篩陽(yáng)性批標(biāo)本量為N,每例非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)費(fèi)用為S,則該批標(biāo)本標(biāo)本常規(guī)檢測(cè)費(fèi)用為SN。剔除雙缺失α-珠蛋白生成障礙性貧血DNA標(biāo)本后，每次取A例DNA標(biāo)本混成1例檢測(cè)，混合樣本有N/A例。每例混合標(biāo)本為陽(yáng)性的概率為KA(0≤KA<1)，如有混合標(biāo)本檢測(cè)出陽(yáng)性，則需單獨(dú)檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性的混合標(biāo)本中的每1例，混合標(biāo)本的檢測(cè)次數(shù)為A+1。則檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的批檢測(cè)費(fèi)用為：F陽(yáng)=N/A×KA×(A+1)×S，混合樣本檢測(cè)結(jié)果陰性的概率為1-KA，檢測(cè)結(jié)果陰性的批檢測(cè)費(fèi)用為：F陰=N/A×(1-KA)×S，批檢測(cè)總體費(fèi)用公式為：F總=F陽(yáng)+F陰=N/A×KA×(A+1)×S+N/A×(1-KA)×S=SN×(KA2+1)/ASN、K相對(duì)穩(wěn)定，F(xiàn)總隨A變化而變化，故F總有最小值，該最小值對(duì)應(yīng)的A值即混合標(biāo)本檢測(cè)費(fèi)用最小的最適標(biāo)本數(shù)。

1.5方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 選取2013年10月東方市珠蛋白生成障礙性貧血群體篩查中初篩為α-珠蛋白生成障礙性貧血陽(yáng)性的標(biāo)本50例，用建立的新非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血批量檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，比對(duì)新方法與傳統(tǒng)方法的檢測(cè)費(fèi)用。

2 結(jié) 果

2.1檢測(cè)限相關(guān)最大標(biāo)本數(shù)檢測(cè)組結(jié)果 分別稀釋3、6、12倍后DNA標(biāo)本能檢測(cè)出結(jié)果且與其確診結(jié)果相同(圖1)。

A：稀釋3倍；B：稀釋6倍；C:稀釋12倍

圖1稀釋后Hb WS雜合子標(biāo)本DNA基因檢測(cè)結(jié)果

2.2干擾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組結(jié)果

2.2.13種非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血標(biāo)本間干擾情況 Hb WS + Hb QS + Hb CS標(biāo)本混合均能檢測(cè)出結(jié)果且結(jié)果為混合突變總和的結(jié)果，如圖2所示。

圖2 Hb WS+Hb QS+Hb CS純合子標(biāo)本混合檢測(cè)結(jié)果

2.2.2非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血標(biāo)本與正常標(biāo)本間的干擾情況 2種非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血標(biāo)本+健康人標(biāo)本混合均能檢測(cè)出結(jié)果且結(jié)果為混合突變總和的結(jié)果(圖3～5)。

圖3 Hb WS純合子+Hb QS純合子+健康人標(biāo)本混合檢測(cè)結(jié)果

圖4 Hb WS純合子+Hb CS純合子+健康人標(biāo)本混合檢測(cè)結(jié)果

圖5 Hb QS純合子+Hb CS純合子+健康人標(biāo)本混合檢測(cè)結(jié)果

2.2.3健康人標(biāo)本之間的干擾情況 健康人標(biāo)本混合均能檢測(cè)出結(jié)果且結(jié)果不受干擾(圖6)。

圖6 3例健康人標(biāo)本混合檢測(cè)結(jié)果

2.3新方法驗(yàn)證結(jié)果 以海南省東方市婦幼保健院送檢標(biāo)本驗(yàn)證新方法可行性。2013年海南省東方市試行的珠蛋白生成障礙性貧血防控實(shí)驗(yàn)室方案：育齡夫婦行血細(xì)胞分析、紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)，血細(xì)胞分析結(jié)果紅細(xì)胞平均體積(MCV)<82 fL和/或紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)<27 pg、紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)≤60%，符合其中一項(xiàng)即進(jìn)行血紅蛋白毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)，電泳結(jié)果HbA2 ≤2.5%或HbA2>3.5%為陽(yáng)性,夫婦雙方只要一方血紅蛋白電泳結(jié)果陽(yáng)性，則夫婦雙方定為高危人群，進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)。該群體篩查實(shí)驗(yàn)室方案下，海南省東方市珠蛋白生成障礙性貧血群篩初篩實(shí)驗(yàn)平均陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為14.58%，代入上述公式，可知每3例標(biāo)本混合后檢測(cè)，檢測(cè)費(fèi)用最低，為傳統(tǒng)檢測(cè)費(fèi)用的77.07%。2013年10月批次α-珠蛋白生成障礙性貧血初篩陽(yáng)性病例50例，剔除3例雙重缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血病例，用新法檢測(cè)，費(fèi)用為原來(lái)的78.72%，以三級(jí)醫(yī)院非缺失α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)門診收費(fèi)143元計(jì)算，該批α-珠蛋白生成障礙性貧血初篩陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)可節(jié)約3 043.04元。

3 討 論

珠蛋白生成障礙性貧血又稱地中海貧血，是由于珠蛋白基因發(fā)生缺失或突變，珠蛋白鏈合成減少或缺失，導(dǎo)致血紅蛋白的α鏈/非α鏈比例失衡，而引起的一組隱性遺傳溶血性疾病。輕者可無(wú)臨床表現(xiàn)，重者以溶血性貧血為主要特征[5]。珠蛋白生成障礙性貧血早在1999年就被WHO人類遺傳病計(jì)劃列為在發(fā)展中國(guó)家開(kāi)展人群預(yù)防的六大疾病之一。是我國(guó)最常見(jiàn)的遺傳性疾病之一。珠蛋白生成障礙性貧血目前尚無(wú)有效又廉價(jià)的治療方法，對(duì)該病進(jìn)行群體篩查、降低珠蛋白生成障礙性貧血重癥胎兒出生概率有重要的意義。

根據(jù)珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類型，珠蛋白生成障礙性貧血可以分為α-珠蛋白生成障礙性貧血、β-珠蛋白生成障礙性貧血、γ-珠蛋白生成障礙性貧血和δβ-珠蛋白生成障礙性貧血等，其中以α-珠蛋白生成障礙性貧血和β-珠蛋白生成障礙性貧血為主要類型[6]。α-珠蛋白生成障礙性貧血是由于α-珠蛋白基因突變而引起α珠蛋白肽鏈的合成受到抑制而導(dǎo)致[7]，又可以根據(jù)其基因改變的不同，分為缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血和非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血。缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血是由于α-珠蛋白基因大片段缺失引起，是α-珠蛋白生成障礙性貧血主要的類型；非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血是由于α-珠蛋白基因發(fā)生了點(diǎn)突變或其調(diào)節(jié)序列發(fā)生突變?nèi)鐔螇A基置換或一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的缺失或插入所致，占α-珠蛋白生成障礙性貧血比例較少。目前發(fā)現(xiàn)至少有六十多種α珠蛋白基因點(diǎn)突變可以導(dǎo)致非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血的發(fā)生，其中大部分突變點(diǎn)位于α2基因，少部分位于α1基因，及極少數(shù)位于α珠蛋白基因簇上α1和α2基因外的地方[8]。中國(guó)南方人群中常見(jiàn)的3種α點(diǎn)突變位點(diǎn)Hb WS、Hb QS、Hb CS位于α2基因。

非缺失α-珠蛋白生成障礙性貧血基因的檢測(cè)有基因測(cè)序、基因芯片、變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP),變性梯度凝膠電泳(DGGE)等技術(shù)，隨著各國(guó)政府對(duì)珠蛋白生成障礙性貧血的日益重視，學(xué)者們用新方法進(jìn)行α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查、診斷的嘗試多見(jiàn)報(bào)道[9]。而隨著PCR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，結(jié)合PCR技術(shù)的點(diǎn)突變分析鑒定非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血的方法成為檢測(cè)技術(shù)的主流，1989年發(fā)明反向點(diǎn)雜交技術(shù)(RDB)后，該技術(shù)在檢測(cè)突變的確定性上僅次于基因測(cè)序。PCR-RDB-個(gè)雜交反應(yīng)能同時(shí)分析一份標(biāo)本中可能存在的多種點(diǎn)突變[10]。

雖然珠蛋白生成障礙性貧血篩查診斷技術(shù)有多種選擇，但大多檢測(cè)費(fèi)用昂貴，多是一例標(biāo)本一份試劑一次檢測(cè)操作，但每年有數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的珠蛋白生成障礙性貧血篩查人群，政府在珠蛋白生成障礙性貧血防治項(xiàng)目上所需費(fèi)用過(guò)于龐大，珠蛋白生成障礙性貧血群體防控要更好地開(kāi)展，需要大幅提高珠蛋白生成障礙性貧血醫(yī)療資源利用率[11]。

α-珠蛋白生成障礙性貧血檢測(cè)的主流產(chǎn)品多基于PCR-RDB技術(shù)，理論上只要模板DNA高于檢測(cè)限2 ng/μL，PCR過(guò)程不會(huì)相互干擾，RDB階段，PCR產(chǎn)物與探針結(jié)合有特異性，理論上也不會(huì)相互干擾。正常提取的DNA標(biāo)本，濃度為10～50 ng/μL，2～5例標(biāo)本混合，單個(gè)樣本濃度2～25 ng/μL，對(duì)基因擴(kuò)增沒(méi)有影響。珠蛋白生成障礙性貧血篩查方法中初篩可以初分α-珠蛋白生成障礙性貧血和β-珠蛋白生成障礙性貧血，再經(jīng)基因診斷，但是初篩不能區(qū)分α-珠蛋白生成障礙性貧血表型陽(yáng)性標(biāo)本為缺失型還是非缺失型，基因檢測(cè)時(shí)需α-珠蛋白生成障礙性貧血的兩種類型同時(shí)檢測(cè)，中國(guó)人群非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血比例較小，因此非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血檢測(cè)多為陰性，適量例數(shù)標(biāo)本混成一例檢測(cè)非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血相當(dāng)于一次實(shí)驗(yàn)可得出多例標(biāo)本的結(jié)果,節(jié)省大量試劑、工時(shí)、儀器損耗、水電等。

現(xiàn)有的珠蛋白生成障礙性貧血篩查診斷技術(shù)，多是一例標(biāo)本一次檢測(cè)操作，針對(duì)大樣本群體篩查批檢測(cè)的改進(jìn)方法，罕見(jiàn)報(bào)道。筆者建立了一種應(yīng)用于珠蛋白生成障礙性貧血群體篩查的非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血批檢測(cè)方法，該法基于PCR-RBD技術(shù)，根據(jù)初篩實(shí)驗(yàn)α-珠蛋白生成障礙性貧血陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均值，概率推算費(fèi)用公式，建立數(shù)學(xué)模型，并依此將適量例數(shù)DNA標(biāo)本混合成一例進(jìn)行非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)中國(guó)人群非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血僅占α-珠蛋白生成障礙性貧血的2%～11%[12]，珠蛋白生成障礙性貧血群體篩查時(shí)，理想狀態(tài)下，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值按此數(shù)據(jù)計(jì)，根據(jù)新的批檢測(cè)方法，套用費(fèi)用公式，批檢測(cè)費(fèi)用僅為常規(guī)檢測(cè)的30%～70%。

珠蛋白生成障礙性貧血群體篩查中應(yīng)用該批檢測(cè)方法可大量減少基因檢測(cè)次數(shù)，縮減人工和試劑費(fèi)用、儀器損耗等。中國(guó)每年珠蛋白生成障礙性貧血群體篩查人數(shù)以百萬(wàn)計(jì)，而基因檢測(cè)費(fèi)用昂貴，應(yīng)用該法能大幅縮減珠蛋白生成障礙性貧血群體防控經(jīng)費(fèi)，極大提高醫(yī)療資源利用率和社會(huì)效益。