郝曉燕，李建平，常曉春，足木熱木，高升旗，陳果，黃全生

(新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】光系統(tǒng)I(Photosystem I，PS I)是由至少13個獨立亞基多肽組成的嵌于光合膜上的色素蛋白復合物，在植物中主要分布于葉綠體類囊體膜基質(zhì)膜區(qū)[1-2]。在光合反應(yīng)中主要起催化光電子傳遞的作用。在高等植物中所有已知的編碼PS I蛋白亞基的基因都已經(jīng)被克隆，依據(jù)這些基因被發(fā)現(xiàn)的先后順序依次命名為PsaA-PsaN。真核生物中PS I蛋白亞基基因由葉綠體或細胞核基因組編碼，其中H亞基(PsaH)是由核基因組編碼的低分子量膜外周蛋白，主要存在于復合蛋白的邊緣[3-4]。鹽地堿蓬(suaedasalsaL.)隸屬藜科(Chenopodiaceae)堿蓬屬(suaeda)，是一種葉片高度肉質(zhì)化的一年生真鹽植物[5]，主要分布于新疆、山東、遼寧等省區(qū)海濱、平原荒漠區(qū)湖邊潮濕鹽土上，是一種典型的鹽堿地指示植物，也是我國最重要的鹽土荒漠建群種之一。隨著土壤鹽漬化日趨嚴重與人口數(shù)量急劇增長矛盾的突出，開發(fā)和有效利用鹽漬土逐漸成為研究熱點，而增強植物的耐鹽性是提高鹽漬土利用效率有效的方法之一。因此，利用現(xiàn)代生物學技術(shù)，通過對鹽生植物耐鹽基因的發(fā)掘和功能研究能夠為改良作物耐鹽性提供理論基礎(chǔ)，還將對有效地改良和利用鹽漬土提供思路。對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護和生態(tài)治理都具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】有關(guān)鹽地堿蓬的研究工作雖然早已起步，涉及了葉片結(jié)構(gòu)、離子平衡、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化系統(tǒng)和光合特性等方面[6-7]。在分子水平上，構(gòu)建了堿蓬鹽脅迫cDNA文庫，篩選出很多可能與耐鹽相關(guān)的基因[8]。目前從堿蓬中克隆的有INPS、P5CS、BADH、CMO、NHX1、TypA1、H+/Ca2+等耐鹽相關(guān)基因[9-12]，且轉(zhuǎn)化了擬南芥、水稻、煙草等植物中并顯著提高了轉(zhuǎn)基因后代的耐鹽能力。【本研究切入點】有關(guān)鹽地堿蓬中PsaH基因的研究尚未見報道。利用RT-PCR技術(shù)從鹽生植物堿蓬中獲得耐鹽相關(guān)基因SsPsaH全長，并對其進行生物信息學分析，以便進一步的了解其分子生物學功能。【擬解決的關(guān)鍵問題】 研究以鹽地堿蓬為材料，從鹽脅迫cDNA文庫中獲得PsaH基因cDNA全長序列，通過生物信息學軟件對其結(jié)構(gòu)和功能進行預(yù)測，為開展該基因的功能研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

鹽地堿蓬(suaedasalsa)種子收獲于阜康水庫鹽堿地，生長至4周大小，以400 mM NaCl脅迫處理48 h取樣，迅速置于液氮中冷凍，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 質(zhì)粒、菌株、試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)Trans-T1感受態(tài)細胞、DNA Marker、TaqDNA聚合酶、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit購自TransGen Biotech；；PowerScriptTMII 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司，DNase 酶Ⅰ、LATaq酶、ExTaq酶、dNTP均購自TaKaRa 公司，T4DNA 連接酶購自Promega 公司，DNA 回收試劑盒購自于OMEGA，引物由北京華大生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與純化，cDNA的合成

材料的總RNA提取按照Life Technologies公司的PureLinkTMRNA Mini Kit 說明書進行操作。以DNaseⅠ純化處理后，通過瓊脂糖凝膠(1.0%)電泳檢驗獲得的各處理樣品總RNA的完整性，并用紫外分光光度計(Eppendorf)檢測各樣品總RNA的純度和濃度。

第一鏈cDNA的合成按照Fermentas公司的First Strand cDNA Synthesis Kit操作說明進行，采用的反轉(zhuǎn)錄引物為Oligo(dT)15。取1 μg 總RNA 作為模板進行RT-PCR，20 μL體系中總RNA 1 μg，DEPC水6 μL，Oligo(dT)151 μL，65℃ 5 min，冰上放置5 min，RNase inhibitor 1.0 μL，5×Reaction buffer 4 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL 和M-MLV(200 U/μL)1 μL，42℃溫育60 min，70℃變性5 min，冰上放置5 min，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SsPsaH基因的克隆

使用Primer Primer 5.0軟件在開放閱讀框兩側(cè)設(shè)計一對能有效擴增SsPsaH的特異性引物(SsPsaH-ORF-F：5’-ATGGCTTCTCTAGCAACCTTTGCC-3’；SsPsaH-ORF-R：5’-TTAGATCTTGCCACGAGGTCCG-3’，擴增片段長度為438 bp)。以合成的第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)體系為50 μL：cDNA 1 μL，引物各1 μL，ExTaq酶0.5 μL，10×PCR Buffer (Mg2+plus)5 μL，dNTP Mixture 4 μL，加ddH2O至50 μL。PCR程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃復性30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min； 4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA回收試劑盒回收目的片段連接到pEASY-Blunt Zero載體進行克隆，陽性克隆經(jīng)酶切鑒定后送北京華大基因科技有限公司完成DNA測序。

1.2.3 SsPsaH基因的生物信息學分析

SsPsaH基因的核苷酸和氨基酸序列分別用NCBI的BLASTn和BLASTp(http://bladt.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行相似性分析；利用在線軟件Protparam (htpp://www.expasy.org/protparam/)分析蛋白的理化性質(zhì)；用TMPred軟件預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)；用SignalP 4.1 Server 在線軟件預(yù)測蛋白的信號肽；用GOR4軟件分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找與PsaH基因同源性較高的其他物種的同源基因進行多序列比對，用MEGA5.0通過鄰接算法(Neighbor-Joining)完成系統(tǒng)進化樹構(gòu)建[13-15]。

1.2.4 SsPsaH基因的組織特異性表達分析

分別提取鹽地堿蓬根、莖、葉3種不同組織的總RNA(方法參見ThermoFisher PureLink RNA Mini Kit使用手冊)。以總RNA為模板，Oligo(dt)18為引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA(方法見Fementers公司的 RevertAid First-strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR試劑盒使用手冊)。獲得的cDNA稀釋10倍后作為RT-PCR定量檢測的模板。SsPsaH基因的表達分析引物(SsPsaH-RT-F：5’-AGGATGTTCTACCCATCACAAA-3’；SsPsaH-RT-R：5’-ATGATACACCAAAAGGAAAGAAAT-3’)，同時以鹽地堿蓬內(nèi)參基因Actin為對照，引物序列(Actin-RT-F：5’-GGGCGAGTACGACGAATCTG-3’，Actin-RT-R：5’-CCTCTCCATCTCTCTCGACCAAAT-3’)，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1 min，隨之94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，28個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽地堿蓬SsPsaH基因的獲得

對400 mM NaCl脅迫處理48 h的堿蓬cDNA文庫進行耐鹽篩選后測序過程中，發(fā)現(xiàn)了1個與菠菜PsaH基因(XP_021B62899.1)同源性高達91%的序列(EST)，對其相應(yīng)的克隆進行完全測序，ORF Finder軟件分析發(fā)現(xiàn)該片段包含完整的CDS序列，將其命名為SsPsaH(GenBank Accession Number：KC4048847)。該基因全長770 bp，含有1個長為438 bp的開放閱讀框，編碼145個氨基酸。圖1

注：M：起始密碼子；*：終止密碼子

Note: M: start codon; *: stop codon

圖1 獲得的SsPsaH基因的cDNA全長序列及其氨基酸序列
Fig.1 Cdna sequence and amino acid sequence of SsPsaH gene obtained

2.2 SsPsaH蛋白的同源性及功能結(jié)構(gòu)域

在NCBI上通過Blast對SsPsaH蛋白序列同源性進行分析。研究表明，SsPsaH蛋白與藜麥(chenopodiumquinoa) 相似性最高為94%，與菠菜(Spinaciaoleracea) 同源性為91%，與甜菜(Betavulgarissubsp)相似性為90%，與木薯(Manihotesculenta)、蓖麻(Ricinuscommunis) 相似性為85%，與毛果楊(Populustrichocarpa)的相似性為84%，與其它植物的氨基酸序列有著高度保守性。由此確定，研究所克隆的SsPsaH基因是屬于光系統(tǒng)I(PSI) H亞基成員。

利用DNAMAN軟件對包含SsPsaH基因在內(nèi)的6種植物的氨基酸序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，SsPsaH基因與其他植物中的PsaH基因一樣包含4個保守的結(jié)構(gòu)功能域典型特征：1個N端的高酸性富集結(jié)構(gòu)域NH-KYGDK，1個轉(zhuǎn)移肽(101-121)代表該基因編碼的氨基酸可能具有跨膜結(jié)構(gòu)域，1個中心疏水結(jié)構(gòu)域和1個C端的高度保守結(jié)構(gòu)域PPKLGPRGKI。這些分析結(jié)果表明克隆的SsPsaH基因?qū)儆赑saH超級家族。圖2

圖2 SsPsaH蛋白與其他物種的氨基酸序列
Fig.2 Comparison of amino acid sequences homology of SsPsaH with different plant PsaH

2.3 SsPsaH蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進化樹分析及理化性質(zhì)預(yù)測

將鹽地堿蓬與藜麥、菠菜、甜菜、擬南芥、木薯、蓖麻等的PsaH氨基酸序列，用相鄰連接法通過MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，迭代值為1 000?？梢钥闯?，堿蓬與菠菜、甜菜、藜麥、擬南芥聚為一組，且與同屬藜科的菠菜、甜菜、藜麥聚在同一個分支，其中與菠菜親緣關(guān)系最近。而蓖麻、毛果楊、木薯、煙草樟子松、大豆、花生聚為一組，其中蓖麻和毛果楊親緣關(guān)系最近且在同一分支。這與NCBI中氨基酸同源性分析的結(jié)果相一致。用在線軟件ExPasy預(yù)測SsPsaH基因所編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。圖3，表1

RcPsaH (蓖麻Ricinuscommunis， XP002516025)；PtPsaH (毛果楊Populustrichocarpa， XP002304206)；MePsah(木薯Manihotesculenta，XP021627101)；NsPsaH (煙草樟子松Nicotianasylvestris， BAA04634)； GmPsaH (大豆Glycinemax， ACU13848)；AhPsaH (花生Arachishypogaea，AB184258)； AtPsaH (擬南芥Arabidopsisthaliana，NP175633)；CqPsaH (藜麥Chenopodiumquinoa，XP02136868)； BvSPsaH (甜菜Betavulgarisstubsp. XP010691337)； SoPsaH (菠菜Spinaciaoleracea， XP021862899)

圖3 SsPsaH系統(tǒng)進化樹構(gòu)建
Fig.3 Phylogenetic tree analysis of SePsaH protein
表1 SsPsaH蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測
Table 1 Physicochemical property analysis of SsPsaH protein

蛋白理化特性characteristics預(yù)測結(jié)果Predicted result編碼的氨基酸個數(shù) Number of coding amino acids145等電點 Theoretical PI9.84分子量 Molecular weight (Mr/103)15372.66負電荷殘基Total number of negatively charged residues (Asp+Glu)8正電荷殘基Total number of positively charged residues (Arg+Lys)16分子式 FormulaC699H1109N183O204S1不穩(wěn)定系數(shù) Instability index (II)47.81平均疏水性 Grand average of hydropathicity (GRAVY)-0.148脂肪系數(shù) Aliphatic index (AI)83.45

2.4 SePsaH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用GOR 4在線分析軟件預(yù)測SePsaH蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，α-螺旋(Helix)占8.97%，延伸鏈(Extended strand)占25.52%，無規(guī)則卷曲(Random coil)占65.52%，無β-螺旋結(jié)構(gòu)存在。圖4

注：A：大寫字母代表SePsaH蛋白質(zhì)的氨基酸序列；h、c、e分別代表α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈. B：短豎線區(qū)(紫色線)，無規(guī)則卷曲；中豎線區(qū)(紅色線)，延伸鏈；長豎線區(qū)(藍色線)，α-螺旋

Note: A. capital letters represent the amino acids sequence of SsPsaH protein; h, c and e represent the alpha helix, random coil and extended strand, respectively. B. short vertical bar area (purple wire): random coil; medium vertical bar area(red wire): extended strand; long vertical bar area(blue wire): alpha helix

圖4 SsPsaH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
Fig.4 Secondary structure prediction of SsPsaH

2.5 SsPsaH蛋白質(zhì)的信號肽預(yù)測

使用SignalP 4.1 Server 在線軟件，對SsPsaH蛋白進行信號肽預(yù)測，研究表明，第21位蘇氨酸殘基原始剪切位點最高分值0.167，綜合剪切位點最高分值0.165，第1位蛋氨酸信號肽最高分值0.228，遠遠小于5，推測SsPsaH蛋白不存在信號肽。圖5，表2

圖5 SsPsaH蛋白的信號肽預(yù)測
Fig.5 Prediction of the SsPsaH protein signal P-NN
表2 SsPsaH蛋白的信號肽預(yù)測數(shù)據(jù)
Table 2 Signal P-NN data prediction of the SsPsaH protein

指標Measure位點Sit得分Score有無信號肽Signal peptideMax. C210.167—Max. Y210.165—Max. S10.228—Mean S1-200.156—D1-200.160無No

Max. C：原始剪切位點的分值；Max. Y：綜合剪切位點的分值；Max. S： 信號肽的分值；Mean S：信號肽分值的平均值；D score：mean S和max. Y 的加權(quán)平均值

Max. C: scores of putative cleavage site; Max. S: scores of signal peptide; Max. Y: scores of synthesis cleavage site; Mean S: average S-score; D score: weighted average of the Mean S and the Max. Y scores

2.6 SsPsaH蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過在線軟件TMPred分析SsPsaH蛋白的跨膜性預(yù)測，可知該蛋白具有1個跨膜結(jié)構(gòu)域(位于第101～121個氨基酸殘基之間)。同時利用PredictProtein對 SsPsaH蛋白進行亞細胞定位預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白可能定位于葉綠體膜系統(tǒng)上。這些結(jié)果與該基因氨基酸序列的結(jié)構(gòu)功能域分析結(jié)果相符。圖6

圖6 SsPsaH蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測
Fig.6 The transmembrane domain prediction of the SsPsaH protein

2.7 SsPsaH基因的組織特異性表達

以鹽地堿蓬的根、莖、葉3種不同組織的RNA為模板進行RT-PCR分析。研究表明，SsPsaH基因在根、莖、葉中均有表達，但在葉和莖中表達量明顯高于根中的表達量。圖7

R: root; S:stem; L:leaf

圖7 SsPsaH基因的組織特異性表達
Fig.7 The expression analysis of the SsPsaH gene

3 討 論

光合作用是植物賴以生存的基礎(chǔ)，也是植物對外界環(huán)境刺激最敏感的生理過程之一。PS I作為光系統(tǒng)復合體蛋白在光合作用中起維持單子傳遞效率和狀態(tài)轉(zhuǎn)化等作用。研究表明，組成PS I 光系統(tǒng)各亞基的變化會影響它們之間的相互作用及蛋白復合體的結(jié)構(gòu)形成。PsaH蛋白作為PS I復合體的一個組成亞基，主要通過與其它幾個亞基PsaD、PsaG、PsaI、PsaL、PsaP、PsaO相結(jié)合以及光合系統(tǒng)的環(huán)狀捕光天線LHCII形成相互作用區(qū)域，從而完成光合作用的同化過程[4、16、17]。Helle等[18]在PSI-H亞基缺乏的擬南芥突變體中發(fā)現(xiàn)，H亞基的缺失會引起PSI-L亞基組份的降低和NADP+酶活性降低至61%，此外還會影響到光電子傳遞的效率。鄭成超等克隆了裂葉牽牛(Pharbitis nil Choisy)PsaH基因[19]，并發(fā)現(xiàn)其受內(nèi)生晝夜節(jié)奏的調(diào)控，明顯受光誘導表達。江玉梅等[20]從(Lycoris radiata)石蒜中克隆了PsaH基因，張林華等[21]從天山雪蓮(Sasussured involucrate Kar.et Kir)中克隆了PsaH基因，Lunde等[22]研究發(fā)現(xiàn)，PsaH基因在維持PS I的穩(wěn)定和光電子傳遞過程中起重要作用。對于該基因的研究大多都集中在光合作用本身。研究是在通過耐鹽脅迫文庫篩選后測序中獲得堿蓬SsPsaH基因全長cDNA序列，而PsaH基因在參與鹽地堿蓬應(yīng)答鹽脅迫的研究還未見報道。

4 結(jié) 論

以鹽地堿蓬為實驗材料，獲得PsaH基因。通過生物信息學軟件分析結(jié)果顯示，該基因編碼蛋白定位于葉綠體膜系統(tǒng)上，是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白，不含信號肽；二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲所占比例最高；有PsaH基因家族的保守結(jié)構(gòu)域，屬于光系統(tǒng)I(PSI)復合蛋白H亞基。系統(tǒng)進化樹分析表明其與藜科的菠菜、甜菜聚為一個組，且同源性高達90%，該基因具有很強的保守性，且在親緣關(guān)系較近的物種中保守性更高。RT-PCR對堿蓬組織特異性表達分析結(jié)果表明，SsPsaH基因主要在堿蓬的莖和葉中表達。