劉 祥 鄭喜群 劉曉蘭

(1. 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾市 161006； 2. 黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米蛋白粉(corn gluten meal)是玉米濕法生產(chǎn)淀粉過程中的主要副產(chǎn)物，因為疏水性氨基酸含量高，水溶性差，加工性能不好，人體消化吸收利用率低等因素的影響，限制了其在食品加工中的應用。與其他谷物蛋白相比，玉米蛋白粉的多肽鏈中含有抗氧化、抗高血壓和促進酒精代謝等功能序列區(qū)[1]，使用合適的蛋白酶處理可以很好地將這些功能序列釋放出來，使玉米蛋白粉成為優(yōu)良的功能食品原料。本課題組[2]曾利用堿性蛋白酶和復合蛋白酶協(xié)同作用玉米蛋白粉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物的·OH清除率、DPPH·清除率和Fe2+螯合能力均較高。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是改變細胞生物活性的關(guān)鍵一步，因為它可以調(diào)節(jié)分子間的相互作用，如蛋白質(zhì)和多肽[3]。蛋白質(zhì)翻譯后修飾可能以糖基化、磷酸化、甲基化等方式出現(xiàn)，而蛋白質(zhì)的糖基化被認為是細胞中重要的翻譯后修飾[4]。因為蛋白質(zhì)糖基化后會產(chǎn)生許多具有特性功能的糖蛋白，這些糖蛋白在生物體內(nèi)起到了調(diào)控生命體正?；顒拥淖饔?，例如生物體的免疫調(diào)節(jié)功能、抗氧化功能和抗疲勞能力都與之有著密切聯(lián)系[5]。

蛋白質(zhì)美拉德糖基化是蛋白質(zhì)、短肽和氨基酸與還原糖之間的一種非酶褐變反應[6]。食品加工過程中，它的反應產(chǎn)物可以影響到食品的風味和色澤[7]。在一些體外試驗研究[8-9]中，美拉德反應產(chǎn)物表現(xiàn)出了抗氧化、抗高血壓和抑菌的生物活性，Marko等[10]研究還發(fā)現(xiàn)，美拉德反應產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長的功能。

殼寡糖是自然界中唯一呈堿性、帶正電、相對分子質(zhì)量在2 000以內(nèi)、水溶性、動物性纖維寡糖，被譽為是人體的第六生命要素。殼寡糖不僅有提高機體的免疫能力、調(diào)節(jié)血脂、保護化學性肝損傷等功能，因具有甜味，還可以作為添加劑改善食品風味[11]。

本研究擬通過美拉德糖基化改性技術(shù)，對雙酶水解玉米蛋白粉的水解產(chǎn)物進行蛋白改性，并研究酶解產(chǎn)物和其美拉德糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米蛋白粉：黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司；

α-淀粉酶：酶活2.0×105U/g，食品級，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；

堿性蛋白酶：(酶活2.1×105U/g)、復合蛋白酶(酶活2.3×104U/g)：食品級，丹麥諾維信公司；

殼寡糖：分子量為≤1 kDa，脫乙酰度為95%，浙江金殼生物化學有限公司；

DPPH：純度≥95%，美國Sigma公司；

其他化學試劑均為實驗室常規(guī)分析純試劑。

1.2 主要儀器和設備

紫外分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司；

pH計：PB-10型，賽多利斯科學儀器有限公司；

冷凍干燥機：PC/PLC-LD-53型，美國MILLROCK公司；

蛋白質(zhì)色譜儀：Purifier 100型，美國GE公司；

集熱式磁力加熱攪拌器：DF-1型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

臺式離心機：TCL-16G型，上海安亭科學儀器廠。

1.3 玉米蛋白水解產(chǎn)物(CGH)的制備

精確稱取一定量的玉米蛋白粉，用50 mmol/L pH 7.0的Tirs-HCl緩沖液配成濃度為10%的蛋白懸液，先后用復合蛋白酶和堿性蛋白酶進行水解。復合蛋白酶加酶量為2.5 g/100 g·底物，水解(溫度50 ℃，pH 7.0)3 h后立即用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應體系pH至8.5，加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶加酶量為2.5 g/100 g·底物，水解(溫度65 ℃，pH 8.5) 2.5 h。水解過程中使用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應體系pH(復合蛋白酶為7.0，堿性蛋白酶為8.5)恒定，水解5.5 h 后于沸水中滅酶15 min，于3 000 r/min離心20 min，將上清液冷凍干燥后備用。

1.4 玉米蛋白水解物美拉德糖基化產(chǎn)物(CGG)的制備

精確稱取一定量的玉米蛋白水解物，用去離子水配成質(zhì)量濃度為40 g/L的玉米蛋白溶液，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應溶液的pH為10，加入殼寡糖的質(zhì)量與玉米蛋白溶液中水解物的質(zhì)量比為1∶1，將玉米蛋白水解物溶液與殼寡糖混合，用1 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)混合后溶液的pH為10，置于70 ℃恒溫水浴鍋中反應10 h。反應結(jié)束后，迅速冷卻樣品，冷凍干燥后備用。

1.5 蛋白含量測定

采用微量凱式定氮法，按GB 5009.5—2010執(zhí)行。

1.6 水解度測定

采用pH-stat法[12]。

1.7 抗氧化活性測定

將凍干后的玉米蛋白水解物和其糖基化產(chǎn)物配成蛋白濃度為0.05，0.10，0.50，1.00，3.00，5.00，7.00 mg/mL的溶液。本試驗設置2組對照，第1組是殼寡糖(濃度設定參考玉米蛋白水解物糖基化產(chǎn)物，梯度濃度為0.025，0.050，0.250，0.500，1.500，2.500，3.500 mg/mL)對照組，第2組是殼寡糖加玉米蛋白水解物(濃度設定參考玉米蛋白水解物糖基化產(chǎn)物，殼寡糖和玉米蛋白水解物混合后溶液的梯度濃度為0.05，0.10，0.50，1.00，3.00，5.00，7.00 mg/mL)對照組。

1.7.1 Fe2+螯合能力測定 參考文獻[12]。

1.7.2 ·OH清除率測定 參考文獻[12]。

1.7.3 DPPH·清除率測定 參考文獻[12]。

1.8 分子量分布的測定

用體積排阻色譜法。使用凝膠色譜柱Superdex Peptide 10/300 GL測定樣品中可溶性蛋白的分子量分布。準確稱取2 mg凍干后玉米蛋白粉水解液和其糖基化樣品，溶解于1 mL pH為7.0 的20 mmol/L的PBS緩沖溶液(含0.15 mol/L NaCl)中，樣品溶液在10 000 r/min離心10 min，將上清液過0.22 μm微孔濾膜后上樣，上樣量為100 μL，用pH 為7.0的20 mmol/L的PBS緩沖溶液(含0.15 mol/L NaCl)洗脫，流速為0.25 mL/min，檢測波長為214 nm。

用來標定分子量的標準物質(zhì)有藍色葡聚糖2 000(2 000 kDa，濃度2 mg/mL)、aprotinine(6 511.51 Da，濃度1 mg/mL)、桿菌肽(1 422.69 Da，濃度2 mg/mL)、氧化性谷胱甘肽(612.63 Da，濃度3 mg/mL)和還原性谷胱甘肽(307.32 Da，濃度3 mg/mL)，使用pH 7.0、20 mmol/L的PBS緩沖溶液配置標準蛋白溶液，將標準蛋白溶液在10 000 r/min 離心10 min，再將上清液過0.22 μm微孔濾膜后上樣，上樣量為100 μL，洗脫液用pH 為7.0、20 mmol/L的PBS緩沖溶液(含0.15 mol/L NaCl)，流速為0.25 mL/min，檢測波長為214 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品中粗蛋白含量

玉米蛋白粉經(jīng)去淀粉、酶解、糖基化反應后分別獲得去淀粉玉米蛋白粉、玉米蛋白水解物、玉米蛋白水解物糖基化產(chǎn)物，各個樣品的粗蛋白含量見表1。

表1 樣品粗蛋白含量Table 1 Sample crude protein content %

試驗中使用的玉米蛋白粉是玉米濕法生產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)物，里面還含有不少的淀粉，經(jīng)過去淀粉預處理后，玉米蛋白粉的蛋白含量提高了23%左右。玉米蛋白水解物的蛋白含量相較于去淀粉玉米蛋白粉的降低了13%左右，因為玉米蛋白中主要是醇溶蛋白和谷蛋白，在水溶液中的溶解性差，酶解后離心，發(fā)現(xiàn)還有少量的玉米蛋白沉淀殘留，此時的水解度為(33.18±1.54)%。玉米蛋白水解物糖基化產(chǎn)物的粗蛋白含量較玉米蛋白水解物的降低了19.36%。

2.2 抗氧化活性

抗氧化能力主要是用于評價樣品對自由基的清除能力，其中·OH可以引起脂質(zhì)的過氧化反應，F(xiàn)e2+螯合能力可以有效地減少·OH的產(chǎn)生，DPPH·是人工合成的，它既是抗氧化劑又是自由基指示劑，所以·OH清除率、Fe2+螯合能力和DPPH·清除率是評價樣品對自由基清除率的重要指標。研究[13]表明玉米蛋白水解物具有一定的抗氧化活性，且玉米蛋白水解物糖基化產(chǎn)物在一定程度上可以提高玉米蛋白水解物的抗氧化活性。

2.2.1 Fe2+螯合能力 蛋白質(zhì)與Fe2+螯合能力可以反映出生命體對礦物元素的吸收利用情況，F(xiàn)e2+可以催化活性氧形成自由基，氧化不飽和脂類，所以蛋白質(zhì)對Fe2+螯合能力越強，越可以減緩蛋白質(zhì)被氧化，說明蛋白具有較強的抗氧化活性。玉米蛋白水解物(CGH)、玉米蛋白水解物美拉德糖基化產(chǎn)物(CGG)及對照樣品在不同濃度下與Fe2+螯合能力見圖1。

由圖1可知，殼寡糖對Fe2+螯合能力較弱，CGG和CGH在低蛋白濃度時Fe2+螯合能力也較弱，隨著蛋白濃度的提高螯合能力不斷加強，具有明顯的量效關(guān)系。在蛋白濃度為0.10～0.50 mg/mL時螯合能力有顯著的提高，此時CGG和CGH的Fe2+螯合能力分別提高了3.1倍和8.9倍。CGH+殼寡糖組的Fe2+螯合能力比CGG組和CGH組的都要小，說明CGH和殼寡糖之間有糖基化反應的發(fā)生。從圖1 的整體趨勢可以看出，玉米蛋白水解物經(jīng)過美拉德糖基化改性后，F(xiàn)e2+螯合能力均有不同程度的提高，說明美拉德糖基化修飾玉米蛋白水解產(chǎn)物可以通過與Fe2+螯合來阻止自由基鏈式反應，消除自由基的氧化對機體造成傷害。汪姣玲[14]研究乳清蛋白美拉德糖基化改性時，發(fā)現(xiàn)改性后的蛋白質(zhì)Fe2+螯合能力是原蛋白的1.64倍，·OH清除率增長了20.82倍，DPPH·清除率增長了2.35倍，與本研究結(jié)果基本一致，美拉德改性技術(shù)可以增強蛋白的抗氧化活性。

圖1 蛋白濃度對Fe2+螯合能力的影響Figure 1 Effect of protein concentration on Fe2+-chelating abilities

從圖1中還可以看出，隨著蛋白濃度的不斷升高，CGH和CGG的Fe2+螯合能力均出現(xiàn)不同程度的降低，可能是玉米蛋白粉沒有經(jīng)過去色素預處理，隨著蛋白濃度的不斷增高，蛋白溶液的顏色不斷加深，會影響測定時的吸光值，使后期Fe2+螯合能力下降。由圖2、3可知，后期隨著蛋白濃度的升高，·OH清除率和DPPH·清除率也出現(xiàn)下降的現(xiàn)象。

2.2.2 ·OH清除率 不同蛋白濃度的玉米蛋白水解物(CGH)、玉米蛋白水解物美拉德糖基化產(chǎn)物(CGG)及對照樣品的·OH清除率測定結(jié)果見圖2。

圖2 蛋白濃度對·OH清除率的影響Figure 2 Effect of protein concentration on hydroxyl radical scavenging activities

由圖2的整體趨勢可以看出，殼寡糖自身具有顯著的·OH 清除能力，且隨著殼寡糖濃度的增加，·OH清除率在不斷的增加，達到一定濃度后，增加趨勢趨于平穩(wěn)。CGG的·OH清除能力比CGH強，且兩者的·OH清除能力在一定濃度范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。CGG清除·OH能力增強，可能是因為它作為金屬螯合劑，能夠與Fe2+螯合并抑制·OH 的產(chǎn)生，這與2.2.1中的試驗結(jié)果一致。CGH在蛋白濃度為3.00 mg/mL時·OH清除率達到最高值為55.98%，而CGG在蛋白濃度為5.00 mg/mL時·OH清除率達到了最高值為90.91%。在蛋白濃度為5.00 mg/mL時對應的CGH、CGH+殼寡糖組和殼寡糖的·OH清除率分別為42.12%，76.38%，73.00%，發(fā)現(xiàn)此時CGG的·OH清除率為90.91%，比CGH、CGH+殼寡糖組和殼寡糖的高，說明CGH和殼寡糖之間發(fā)生了交聯(lián)反應。美拉德糖基化反應對玉米蛋白水解物的·OH清除率有較為明顯的加強，與尹晨玲等[15]研究的美拉德反應可以提高酶解后蛋白的·OH清除率結(jié)果相一致。

2.2.3 DPPH·清除率 不同蛋白濃度的玉米蛋白水解物(CGH)、玉米蛋白水解物美拉德糖基化產(chǎn)物(CGG)及對照樣品的DPPH·清除率測定結(jié)果見圖3。

DPPH是一種含發(fā)色團的化合物，溶解在乙醇中后呈深紫色，可直接與抗氧化物質(zhì)反應。由圖3可知，CGH、CGG和殼寡糖對DPPH·都有一定清除能力，在蛋白濃度為0.50～7.00 mg/mL 時CGH+殼寡糖組的DPPH·清除率約為CGH和殼寡糖的簡單加和，而CGH的DPPH·清除率比CGH+殼寡糖組的低，可以推斷CGH與殼寡糖發(fā)生了交聯(lián)反應。不同濃度下CGG的DPPH·清除率都要比CGH的高，說明美拉德糖基化改性改善了CGH對DPPH·的清除能力，可能是與CGH共價結(jié)合的殼寡糖能夠向DPPH·提供氫原子，使DPPH·形成穩(wěn)定的DPPH-H物質(zhì)。Gottardi等[16]在研究小麥蛋白水解物時，發(fā)現(xiàn)美拉德糖基化反應會產(chǎn)生一種具有增強抗氧化能力的產(chǎn)物，與本研究結(jié)果一致。CGG和CGH在蛋白濃度均為5.00 mg/mL時DPPH·清除率達到了最大值，分別為61.75%和29.49%，此時殼寡糖和CGH+殼寡糖組的值為69.88%和86.49%，比CGG和CGH的高。說明美拉德糖基化反應可以有效地提高蛋白水解物的DPPH·清除率，且影響自由基清除率的不是簡單依靠殼寡糖和蛋白水解物對自由清除率的簡單疊加。另外，從圖3的整體變化趨勢可以得到，蛋白水解物的抗氧化活性與蛋白濃度之間存在劑量依賴關(guān)系。這與Oh等[17]研究山藥蛋白及其糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性時，提出的蛋白濃度與抗氧化物活性之間有劑量依賴關(guān)系相符。

總的來說，玉米蛋白水解物經(jīng)美拉德糖基化修飾后，抗氧化活性顯著增強，且抗氧化活性與蛋白濃度之間具有量效關(guān)系。

圖3 樣品的蛋白濃度對DPPH·清除率的影響Figure 3 Effect of protein concentration on DPPH radical scavenging activities

2.3 CGH、CGG的分子量分布

采用凝膠過濾色譜分析玉米蛋白酶解產(chǎn)物和糖基化產(chǎn)物的分子量分布情況。玉米蛋白酶解產(chǎn)物和其糖基化產(chǎn)物的分子量分布見圖4。

如圖4所示，經(jīng)計算可知，在復合蛋白酶和堿性蛋白酶協(xié)同作用下，CGH的分子量在6 500 Da以下的約占總數(shù)的98%，其中分子量在1 000 Da以下的小分子多肽約占總數(shù)的75%，可以看出復合蛋白酶和堿性蛋白酶協(xié)同水解能很好地將玉米蛋白粉中大蛋白分子切割成小分子玉米多肽。CGG的分子量在6 500 Da以下的約占總數(shù)的96%，其中分子量在1 000 Da以下的小分子多肽約占總數(shù)的71%。分子量在200 Da以下的CGH約占總數(shù)的18%，而CGG約占總數(shù)的5%，可以看出玉米蛋白經(jīng)美拉德糖基化后，美拉德糖基化產(chǎn)物的分子量略有升高。據(jù)報道[18]小分子多肽與大分子蛋白質(zhì)相比，具有可以迅速提供能量、消化吸收利用率高和生物活性強等優(yōu)點。再由圖1～3可以看出，玉米蛋白水解產(chǎn)物具有較強的抗氧化能力，所以玉米蛋白粉經(jīng)過雙酶協(xié)同作用后可以提高玉米蛋白粉在食品行業(yè)的利用價值。

圖4 CGH和CGG的分子量分布洗脫圖譜Figure 4 Molecular weight distribution elution curve of CGH and CGG

3 結(jié)論

美拉德糖基化可以增強玉米蛋白水解物的抗氧化活性，CGH和CGG隨著蛋白濃度的增加，抗氧化活性上升趨勢明顯，在一定的蛋白濃度范圍內(nèi)劑量依賴關(guān)系明顯。后續(xù)將利用細胞試驗繼續(xù)研究CGH和CGG的抗氧化活性，并對比兩者之間的區(qū)別。美拉德糖基化改性蛋白質(zhì)在食品中的應用潛力巨大，并且正在逐步擴大到功能食品行業(yè)中，本研究在功能食品生產(chǎn)中具有廣闊的應用前景。