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ARB類藥物對2K1C型腎血管性高血壓大鼠左室重構(gòu)方面的類效應(yīng)及作用研究

2018-11-06 00:42:58,,,
關(guān)鍵詞:膠原類藥物左室

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目前高血壓的治療,仍以藥物治療為主,非藥物治療為輔[1]。高血壓的藥物治療主要有利尿劑、β腎上腺素能受體阻滯劑、鈣離子通道阻滯劑(CCB)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)與血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體阻滯劑(ARB)[2]。諸多藥物中,臨床醫(yī)生面臨著藥物的選擇問題。自1994 年第一個ARB氯沙坦應(yīng)用于臨床以來,對ARB 的認(rèn)識也不斷提升,ARB 類降壓藥是一種長效、平穩(wěn)、強效的降壓藥,通過選擇性阻斷AngⅡ與AngⅡ1型受體(AT1R)結(jié)合發(fā)揮其降壓及保護靶器官的作用,在逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)方面有著積極的作用[3-5],在心血管疾病的治療中得到越來越多臨床醫(yī)生的重視。本實驗使用4種ARB 類藥物(氯沙坦、纈沙坦、替米沙坦、厄貝沙坦)對實驗性腎血管性高血壓大鼠進行干預(yù),從整體、器官、細(xì)胞和分子水平4個層面來對比研究不同ARB類藥物對腎血管性高血壓大鼠心肌的保護作用,了解ARB 類藥物在改善左室重構(gòu)方面有無類效應(yīng),并初步探討核因子-κB(NF-κB)的表達在高血壓左室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑 氯沙坦,杭州默沙東制藥有限公司(50 mg);替米沙坦,上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司(80 mg);厄貝沙坦,杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司(150 mg);纈沙坦,北京諾華制藥有限公司(80 mg);NF-κB兔單克隆抗體,北京博奧森生物技術(shù)有限公司;膠原Ⅰ、膠原Ⅲ單克隆抗體,武漢博士德生物工程公司;SP試劑盒,武漢博士德生物工程公司;DAB 顯色試劑,武漢博士德生物工程公司;4%多聚甲醛,我院配制。

1.1.2 實驗動物 健康雄性SD大鼠56只,體重261 g±12 g,由我院動物實驗中心提供。將動物分別放置在16個籠子,每個籠子放4只大鼠,并將其放在標(biāo)準(zhǔn)的實驗房進行喂養(yǎng),溫度保持在22 ℃,與此同時給予一定的光照,并進行常規(guī)的喂養(yǎng),飲水自由。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 建立高血壓動物模型并進行分組處理。56只大鼠隨機分為空白對照組(n=8)、假手術(shù)組(n=8)及模型組(n=40),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,模型組采用改良的二腎一夾(2K1C)的方法建造腎血管性高血壓大鼠模型,模型建立成功后,隨機分為4個治療組(n=8)及1個模型對照(手術(shù))組(n=8)。

1.2.2 模型建立方法 模型以改良的二腎一夾方法建立。4個治療組及模型對照組給予1%的戊巴比妥鈉,然后根據(jù)40 mg/kg的含量向大鼠腹腔內(nèi)部注射進行麻醉處理,等動物完全麻醉以后,即肌肉的張力以及角膜反射等全部消失為止,讓大鼠處于仰臥位,固定到手術(shù)臺上。將其腹部皮膚的毛全部剪掉,并使用碘伏進行消毒、鋪巾處理,然后在腹部正中左側(cè)做一個切口,離劍突1 cm左右,切口長度4 cm,將腹腔打開,分離臟器,找到腹主動脈以及腹主靜脈的位置,在腎動脈的分支部位使用玻璃分針將腎動脈分離出來,使用4號針頭進行穿線結(jié)扎,引起腎動脈部位狹窄。經(jīng)過消毒處理以后,每只肌肉注射青霉素4×104U,持續(xù)用藥1周。手術(shù)完成后,動物置保溫箱中進行加熱處理,蘇醒過后放到普通籠子中,禁食禁水1 d。動物恢復(fù)正常排尿以后,才可以正常飲食飲水。假手術(shù)組給予1%的戊巴比妥鈉按照40 mg/kg麻醉大鼠,待動物麻醉完全后在無菌條件下給予手術(shù),只剝離腎動脈,不結(jié)扎,術(shù)后給予青霉素4×104U腹腔注射,待動物清醒后,稍微加熱些許時間,然后單獨放置,禁水禁食24 h,進行觀察。手術(shù)后4周,每周測量清醒狀態(tài)下大鼠動脈收縮壓,如果其收縮壓高于術(shù)前30mmHg(1mmHg=0.133 kPa),并且大于150 mmHg認(rèn)為造模成功。

1.2.3 干預(yù)方法 建模后大鼠藥物干預(yù)方法:各治療組按照藥品說明書推薦的臨床使用劑量分別給予氯沙坦(30 mg/kg)、纈沙坦(30 mg/kg)、替米沙坦(30 mg/kg)、厄貝沙坦(50 mg/kg)灌胃;對假手術(shù)組、空白對照組以及模型對照組進行生理鹽水灌胃處理,每日1次。

1.3 觀察指標(biāo) 比較各組大鼠心肌組織病理及結(jié)構(gòu)變化,觀察血壓、心臟指數(shù)、左心室指數(shù)及NF-κB、Ⅰ型膠原和Ⅲ 型膠原的表達。①每周測量1次清醒安靜狀態(tài)下大鼠尾動脈收縮壓。②測定左心室指數(shù)及心臟指數(shù):給藥8周后,術(shù)前禁食12 h,每只大鼠稱取體重(BW)后,采用1%的戊巴比妥鈉按照40 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射麻醉,解剖后迅速取出心臟,投入4 ℃冰磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中,使離體心臟收縮3個或4個心動周期,射出左心室內(nèi)殘余血液,稱心臟的重量(HW),然后沿房室交界處去除左右心房及大血管,去除右心室游離壁,吸水紙吸干殘余水分,將左心室進行稱重(LVW),HW/BW表示心臟指數(shù),LVW/BW表示左心室指數(shù)。③選取一部分左心室心肌,通過濃度為4%的多聚甲醛進行固定處理,部分心肌組織-70 ℃低溫冰箱保存,使用常規(guī)的HE法染色處理,在光鏡下觀察心肌細(xì)胞以及間質(zhì)的變化。④采用SP免疫組化法檢測心肌組織中NF-κB、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的表達。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理及結(jié)構(gòu)變化 空白對照組:心肌纖維走行沒有異常并且排列非常整齊,心肌細(xì)胞的細(xì)胞核為圓形,位于細(xì)胞的正中央位置,心肌的間質(zhì)以及微血管等結(jié)構(gòu)都基本正常。假手術(shù)組:心肌排列緊密,纖維組織無增生,血管內(nèi)皮完好,心肌細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,居細(xì)胞中央。模型對照組:心肌纖維組織增生,心肌扭曲斷裂、纖細(xì),細(xì)胞萎縮、水腫,心肌細(xì)胞灶樣壞死,部分心肌纖維消失,淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤,纖維細(xì)胞增生,黏液樣變性,心肌毛細(xì)血管增多,管腔狹窄,管壁增厚。氯沙坦組:心肌間質(zhì)纖維增生,肌纖維排列較緊密,心肌組織部分?jǐn)嗔?,心肌纖維變細(xì),血管外可見外膜增生,心肌纖細(xì),少量淋巴細(xì)胞浸潤。替米沙坦組:可見肌纖維斷裂,血管外滲出,小灶樣纖維壞死,血管外可見纖維點狀增生,內(nèi)膜下纖維增生,少量淋巴細(xì)胞。纈沙坦組:心肌細(xì)胞水腫明顯,少量纖維細(xì)胞增生,血管內(nèi)膜增生,組織充血,肌纖維排列較稀疏,少量纖維組織變性。厄貝沙坦組:心肌組織充血水腫,血管周圍少量纖維化,淋巴細(xì)胞浸潤,內(nèi)膜下纖維組織增生,蛋白沉積和肌纖維斷裂,排列不齊,心肌組織可見點狀缺血壞死,纖維組織增生。詳見圖1。

圖1 心肌組織HE 染色(×200)

2.2 各組大鼠血壓、心臟指數(shù)、左心室指數(shù)比較 模型對照組與空白對照組比較,心臟指數(shù)及左心室指數(shù)均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示左心室負(fù)荷加重。假手術(shù)組與空白對照組比較,血壓、心臟指數(shù)及左心室指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組與模型對照組比較,血壓、心臟指數(shù)及心室指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明大鼠血壓升高是大鼠腎動脈部分狹窄所致。各治療組與模型對照組比較,用藥8周血壓、心臟指數(shù)、左心室指數(shù)均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。用藥8 周后,厄貝沙坦組較其他組血壓下降明顯,降壓效果最好(P<0.05);氯沙坦組用藥后血壓高于其他3組,降壓效果稍差(P<0.05);氯沙坦組心臟指數(shù)、左心室指數(shù)高于厄貝沙坦、替米沙坦、纈沙坦組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組血壓、心臟指數(shù)及左心室指數(shù)比較(±s)

2.3 各組大鼠 NF-κB、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達的比較 模型對照組與空白對照組比較,實驗結(jié)束時NF-κB、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。假手術(shù)組與空白對照組比較,NF-κB、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組與模型對照組比較,NF-κB、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。厄貝沙坦組、纈紗坦組、替米沙坦組、氯沙坦組與模型對照組比較,NF-κB、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4個治療組用藥8 周后組間比較:氯沙坦組NF-κB的表達高于厄貝沙坦組、替米沙坦組以及纈沙坦組(P<0.05),而厄貝沙坦組、替米沙坦組、纈沙坦組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達各用藥組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組NF-κB、Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達比較(±s) ng/mL

3 討 論

近年來的研究證明,心室重構(gòu)與高血壓病的預(yù)后密切相關(guān),而左室肥厚為左室重構(gòu)的一種表現(xiàn)形式,是一個獨立的危險因素[6]。在諸多高血壓治療藥物中,降壓本身的效果都可以改善由高血壓引起的左室負(fù)荷過重,進而阻止左室重構(gòu)的發(fā)展。ARB類藥物在降壓的同時,其自身的藥物作用機制本身也可對左室重構(gòu)起到保護作用。對于高血壓發(fā)病以及靶器官受損的病人來說,腎素血管緊張素系統(tǒng)具有非常重要的作用。AngⅡ?qū)儆谠撓到y(tǒng)中一個非常重要的效應(yīng)因子[7]。AngⅡ1 型受體屬于作用于靶細(xì)胞的公共通路,主要是用來進行腎素-血管緊張素系統(tǒng)的級聯(lián)反應(yīng)。血管緊張素的血流動力學(xué)以及非血流動力學(xué)作用有很多,如影響水電解質(zhì)平衡、提高血壓以及對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響等,這些均被證實為AngⅡ1型受體被AngⅡ激活后的主要效應(yīng)[8]。AngⅡ1型受體能夠?qū)ψ笮氖业闹貥?gòu)產(chǎn)生很多作用,如能夠造成左心室的心肌細(xì)胞肥大并且出現(xiàn)間質(zhì)重塑的現(xiàn)象。根據(jù)相關(guān)報道,不管是在體內(nèi)還是體外進行細(xì)胞培養(yǎng),血管緊張素都能夠造成小鼠以及成年大鼠或者人的心肌間質(zhì)出現(xiàn)纖維細(xì)胞增殖,并且還會產(chǎn)生大量的膠原蛋白,甚至可以使膠原蛋白的成分發(fā)生變化,尤其是增加Ⅰ型膠原蛋白[9]。除此之外,還能夠?qū)δz原蛋白的降解產(chǎn)生一定的抑制作用,最終會造成左心室出現(xiàn)僵硬以及舒張功能下降的現(xiàn)象[10]。本研究發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠心臟指數(shù)增高,Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白的表達也明顯增高,說明存在左室負(fù)荷加重,有左室重構(gòu)發(fā)生的跡象。治療組大鼠經(jīng)ARB類藥物干預(yù)后,心臟指數(shù)、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白的表達較模型對照組均明顯減少。表明4種ARB類藥物對高血壓大鼠左室重構(gòu)均有不同程度的改善。

近年來的研究認(rèn)為NF-κB在炎癥反應(yīng)過程中起著重要的作用,故推測其可能在高血壓病理過程中亦起重要作用[11]。對于很多的炎性細(xì)胞因子來說,NF-κB是其共同的通路,在介導(dǎo)各種炎性因子合成的過程中發(fā)揮著非常重要的作用[12]。其與炎癥細(xì)胞因子的相互作用有:NF-κB活化后,可增強腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-3(IL-3)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)等炎性細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄,使TNF-α、IL-1、IL-3產(chǎn)生和釋放增多,同樣,炎性細(xì)胞因子也能反過來激活NF-κB的活性,進而使得TNF-α和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)再次激活NF-κB;NF-κB活化后還可使白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)產(chǎn)生和釋放增多,導(dǎo)致最初的炎癥信號進一步放大。如果血管緊張素和其他受體相結(jié)合,就會引起循環(huán)中NF-κB被迅速地激活,并且能夠?qū)F-κB產(chǎn)生一定的刺激,使其表達增加,最終造成炎性因子的表達升高,如IL-6、TNF-α等[13]。ARB類藥阻斷了AngⅡ與受體結(jié)合,進而阻斷了其引起的炎癥細(xì)胞因子的表達增加,同時抑制其收縮血管與刺激腎上腺素釋放醛固酮作用的機制,達到控制血壓、保護心血管系統(tǒng)的作用。本研究顯示,NF-κB的表達在各治療組大鼠的心肌組織中較模型對照組下降,可以推斷ARB類藥物的作用機制中,其中某一環(huán)節(jié)對NF-κB起到了抑制作用。NF-κB的表達被抑制減少了炎性細(xì)胞因子的合成與分泌,對降低血壓同樣也起到了一定的作用。

左室重構(gòu)表現(xiàn)為左心室的負(fù)荷加重,進而導(dǎo)致心肌做功增加,初期為代償性,隨著病情的惡化,轉(zhuǎn)為失代償狀態(tài),可引起心肌細(xì)胞的肥大,同時還會伴有重量增加以及間質(zhì)纖維的增生。通過細(xì)胞以及分子水平的分析可以得知,大體上可以分為3個環(huán)節(jié),分別是細(xì)胞外的信號刺激、細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞核內(nèi)部的基因轉(zhuǎn)錄活化。本質(zhì)都是肥大細(xì)胞產(chǎn)生刺激信號,并對細(xì)胞核內(nèi)的基因表達產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。此外,細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路屬于細(xì)胞外刺激以及細(xì)胞核內(nèi)的基因活化的偶聯(lián)環(huán)節(jié),具有非常重要的作用[14]。本實驗中,模型對照組中NF-κB陽性表達明顯高于各個治療組,可以推斷ARB類藥物抑制了心肌組織中NF-κB的激活,宏觀上可以解釋為ARB類藥物可以作為NF-κB的抑制劑。實驗結(jié)束后,各個治療組NF-κB的表達較模型對照組明顯降低,大鼠的血壓、心臟指數(shù)、左心室指數(shù)、Ⅰ型膠原、 Ⅲ型膠原含量均低于模型對照組??紤]ARB 類藥物改善左心室的重構(gòu)主要包括以下幾方面的內(nèi)容:①逐漸降低壓力負(fù)荷以及心肌局部血管緊張素的含量。由于壓力負(fù)荷的不斷下降,能夠減輕心肌肥厚,但這不是主要的原因。Rysa[15]研究發(fā)現(xiàn),采用除去血管緊張素以外的肼屈嗪、利血平和氫氯噻嗪的三聯(lián)降壓治療方法能夠降低血壓,并且對心肌肥厚減輕的程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于腎素特異性抑制劑的作用,這說明降壓治療具有一定的意義,但是非壓力負(fù)荷容易導(dǎo)致心肌肥厚,這一點是必須要注意的;②降低炎癥反應(yīng)。NF-κB 活化后,可增加炎性細(xì)胞因子的合成,炎性細(xì)胞因子在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,高血壓的發(fā)生又使得左心室負(fù)荷加重,促進左心室重構(gòu)的發(fā)生,環(huán)環(huán)相扣。由于ARB 類藥物可以顯著抑制NF-κB 的活性,從而降低炎癥因子的表達,最終使得心肌肥厚的程度不斷下降。這與Rysa[15]的研究相似,表明ARB類藥物對于降低血壓以及逆轉(zhuǎn)左心室重構(gòu)方面有著非常重要的作用。表明對NF-κB 的激活進行干預(yù),很有可能成為治療高血壓心室重構(gòu)的新靶點。

ARB類藥物結(jié)構(gòu)存在很大的差異,可以分為3類。①三苯四咪類:以氯沙坦為代表,是一種前體藥物,能夠在肝臟中進行逆轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)換成為活性的代謝產(chǎn)物EXP3174,然后可以對血管緊張素的Ⅰ型受體進行選擇性阻斷并不斷地發(fā)揮作用。此外,依貝沙坦、坎地沙坦以及他所沙坦也屬這類藥物;②非三苯四咪喹類:以依普羅沙坦、厄貝沙坦、替米沙坦為代表,本身即為活性物質(zhì),不需要生物學(xué)轉(zhuǎn)換;③非雜環(huán)類:以纈沙坦為代表,不是前體藥,能夠直接作用于受體并發(fā)揮相應(yīng)的作用。所謂的類效應(yīng),至今為止還沒有科學(xué)的、臨床甚至是管理上的定義。因為沒有形成一致的結(jié)論,目前存在很多的解釋。每種藥物都有很多的機制,如果這些藥物的作用機制相同,就屬于同一類藥物。從某一角度來說,可以認(rèn)為ARB類藥物可通過降低NF-κB的表達來改善心室重構(gòu)的過程,雖然功能基團不同,但具有相似的作用機制,故可以認(rèn)為在此方面具有類效應(yīng)。本實驗推斷ARB類藥物可以作為NF-κB的抑制劑,心血管疾病如高血壓、冠心病、心力衰竭、心肌病等多種常見病,ARB類藥物均能起到很好的治療作用。本實驗?zāi)康氖峭ㄟ^ARB類藥物在高血壓中的治療,從逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)方面的研究入手,探討4種ARB類藥物之間是否存在類效應(yīng)的作用,并進一步為NF-κB的表達在高血壓心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中的作用尋找理論依據(jù)。

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