高麗娟 劉莉 劉華生 王科軍 鄭南

[摘要] 目的 觀察胰泰復方對胰腺纖維化大鼠腺泡細胞凋亡的影響。 方法 將60只SD雄性大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、清胰利膽顆粒組和胰泰復方高、中、低劑量組。腹腔注射13.3% L-精氨酸造模后各組給藥，胰泰復方高、中、低劑量組分別給予胰泰復方22.32、11.16、5.58 g/kg，清胰利膽顆粒組給予清胰利膽顆粒2.678 g/kg，空白組、模型組均給予2 mL生理鹽水。各組連續(xù)治療30 d后取胰腺，用于TUNEL細胞凋亡檢測及Caspase-3的Western blot和免疫組化檢測。 結(jié)果 TUNEL細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，胰泰復方各治療組凋亡細胞面密度明顯少于模型組（P < 0.05），胰泰復方中劑量組明顯少于胰泰復方低劑量組（P < 0.05）。Western blot和免疫組化檢測Caspase-3蛋白表達結(jié)果顯示，胰泰復方高、中劑量組與模型組比較下降顯著（P < 0.05），胰泰復方中劑量組比胰泰復方高劑量組下降亦顯著（P < 0.05）。 結(jié)論 減少胰腺腺泡細胞凋亡可能是胰泰復方延緩胰腺纖維化的機制之一。

[關鍵詞] 胰腺纖維化；胰泰復方；細胞凋亡；L-精氨酸

[中圖分類號] R576 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（c）-0019-04

The effect of Yitai Compound on apoptosis of acinous cells in the rats with pancreatic fibrosis

GAO Lijuan1，2 LIU Li3 LIU Huasheng2 WANG Kejun4 ZHENG Nan2

1.Department of Rheumatology， the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 2.Basic Medical College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 3.Department of Cardiology， the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 4.Integrated Chinese and Western Medicine College， Binzhou Medical University， Shandong Province， Yantai 264003， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Yitai Compound on apoptosis of acinous cells in the rats with pancreatic fibrosis. Methods Sixty SD male rats were randomly divided into blank group， model group， Qingyi Lidan Granules group， and high， medium， low dose of Yitai Compound groups by random number table method. After creation of models by intraperitoneal injection of 13.3% L-arginine， all rats were given the treatment. The rats in high， medium， low dose of Yitai Compound groups were respectively given Yitai Compound 22.32， 11.16， 5.58 g/kg， Qingyi Lidan Granules group was given Qingyi Lidan Granules 2.678 g/kg， both blank group and model group were given 2 mL normal saline. The treatment lasted for 30 days. After treatment， the pancreas was taken for detecting the apoptosis by TUNEL and the expression of Caspase-3 by Western blot and immunohistochemmistry. Results The results of cell apoptosis by TUNEL showed that the area density of apoptosis in all Yitai Compound groups was significantly less than that of model group （P < 0.05）， which of medium dose of Yitai Compound group was less than that of low dose of Yitai Compound group （P < 0.05）. The expression of Caspase-3 by Western blot and immunohistochemmistry showed that high， medium dose of Yitai Compound groups were lower than that of model group （P < 0.05）， and medium dose of Yitai Compound group was lower than that of high dose of Yitai Compound group （P < 0.05）. Conclusion Reducing the apoptosis of acinous cells in pancreas may be one of the mechanisms for Yitai Compound delaying pancreatic fibrosis

[Key words] Pancreatic fibrosis； Yitai Compound； Cell apoptosis； L-arginine

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是指多種原因引起的胰腺組織的炎性疾病，因炎癥的持續(xù)性、反復性導致胰腺腺泡不同程度的萎縮、變形，部分胰腺纖維化、鈣化，最終功能損壞。該病臨床表現(xiàn)多樣，病程遷延，并發(fā)癥多，一般預后不良。細胞凋亡是指機體中正常組織細胞在受到各種刺激后出現(xiàn)的、按照一定程序發(fā)生的自發(fā)性死亡[1]。細胞凋亡對維持機體穩(wěn)態(tài)、組織分化、器官發(fā)育等有重要意義。Caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的必需因子，是細胞凋亡的主要執(zhí)行者，亦是多種凋亡途徑的共同下游效應部分。本研究前期在血清學、組織形態(tài)學方面對胰泰復方防治胰腺纖維化做了很多研究與報道，并用13.3% L-精氨酸溶液成功復制大鼠胰腺纖維化動物模型。本研究擬通過觀察Caspase-3蛋白的表達變化，探討胰泰復方在胰腺腺泡細胞凋亡方面防治CP胰腺纖維化的作用機制。現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SPF級健康SD雄性大鼠，6月齡，體重（180±20）g，黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[動物合格證號：SCXK（黑）2015-003]。標準化飼養(yǎng)，室溫20～22℃，濕度40%～70%，每日光照12 h。

1.2 藥物

胰泰復方組成：茯苓15 g、人參15 g、當歸15 g、炒白術15 g、柴胡15 g、桃仁10 g、紅花10 g、佛手10 g、郁金10 g、甘草10 g（藥物均來自黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院草藥局），加8倍量水浸泡藥物4 h，煎煮1 h，濾出藥液，再加6倍水，煎煮1 h，2次濾液合并，濃縮成濃度為1∶1的水煎劑。清胰利膽顆粒由長春銀諾克藥業(yè)有限公司提供（批號：20160951）。

1.3 分組與給藥

按隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為空白組、模型組、清胰利膽顆粒組、胰泰復方低劑量組、胰泰復方中劑量組、胰泰復方高劑量組。除空白組外，其余各組大鼠在左下腹腔注射13.3% L-精氨酸3次，3 d給藥1次，每次分2次給藥，按大鼠2 g/kg計算劑量，空白組用2 mL生理鹽水（造模標準參照文獻[11]）。自第11天開始灌胃，胰泰復方中劑量組為11.16 g/kg（按正常成人與大鼠給藥劑量系數(shù)折算）；胰泰復方低劑量組為5.58 g/kg（胰泰復方中劑量組劑量的1/2倍）；胰泰復方高劑量組為22.32 g/kg（胰泰復方中劑量組劑量的2倍）；清胰利膽顆粒組為2.678 g/kg（正常成人30 g/d）；空白組、模型組用2 mL生理鹽水，每日1次，連續(xù)30 d。

1.4 標本采集

大鼠斷頸處死，開腹用眼科剪取胰腺分兩部分：一部分錫紙包裹后立即置于液氮，再轉(zhuǎn)至-80℃冰箱，用于Western blot檢測；一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于原位末端標記法（TUNEL）細胞凋亡檢測及免疫組化檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法

用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 原位細胞凋亡檢測結(jié)果

凋亡細胞主要表達于細胞核，TUNEL檢測在顯微鏡下觀察凋亡細胞為棕色，正常細胞為藍紫色。各組原位凋亡細胞TUNEL檢測結(jié)果顯示，空白組為正常藍紫色細胞，模型組可見最多的棕色凋亡細胞，清胰利膽顆粒組可見較多棕色凋亡細胞，胰泰復方高劑量組可見正常藍紫色細胞及少量棕色凋亡細胞，胰泰復方中劑量組亦可見正常藍紫色細胞及少量棕色凋亡細胞，胰泰復方低劑量組可見較多棕色凋亡細胞（圖1，封四）。

原位細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，模型組胰腺細胞凋亡細胞面密度明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；各治療組胰腺細胞凋亡細胞面密度明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；胰泰復方中劑量組胰腺細胞凋亡細胞面密度明顯低于胰泰復方低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 免疫組織化學檢測胰腺Caspase-3蛋白的表達

顯微鏡下細胞漿或細胞核中Caspase-3有表達者為棕黃色顆粒，無棕黃色顆粒則為無表達。Caspase-3抗原陽性細胞呈棕黃色，胞漿胞核均有表達，但以胞漿表達為主。各組胰腺Caspase-3蛋白表達免疫組化檢測結(jié)果顯示，空白組中未見棕黃色顆粒，模型組細胞胞漿胞核中均可見較多棕黃色顆粒，清胰利膽顆粒組也可見較多棕黃色顆粒，胰泰復方高劑量組棕黃色顆粒較少，胰泰復方中劑量組棕黃色顆粒也較少，胰泰復方低劑量組可見較多棕黃色顆粒（圖2，封四）。

免疫組化檢測胰腺Caspase-3蛋白表達統(tǒng)計結(jié)果顯示，模型組Caspase-3蛋白表達明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；胰泰復方高、中劑量組Caspase-3蛋白表達明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；胰泰復方中劑量組Caspase-3蛋白表達低于胰泰復方高、低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 Western-blot檢測胰腺Caspase-3蛋白的表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組Caspase-3蛋白表達明顯上調(diào)，高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。治療后，各治療組Caspase-3蛋白表達明顯下降，顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。胰泰復方中劑量組與胰泰復方高、低劑量組比較顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表3、圖3。

1.空白組；2.模型組；3.清胰利膽顆粒組；4.胰泰復方高劑量組；5.胰泰復方中劑量組；6.胰泰復方低劑量組

圖3 各組胰腺組織Caspase-3蛋白表達情況

3 討論

細胞凋亡是機體用來去除異常生長細胞和老化細胞的一種重要機制，是維持細胞群體動態(tài)平衡的重要因素[2-5]，然而過多或過少的細胞凋亡都會引起疾病的發(fā)生。細胞凋亡可由多種因素誘導（如病毒感染、藥物、缺氧等），是一個信號依賴的過程，其在形態(tài)學上表現(xiàn)為核染色質(zhì)凝縮、胞質(zhì)濃縮、DNA大規(guī)模斷片化、細胞膜內(nèi)陷、發(fā)泡形成凋亡小體[6-9]。

Caspase亦稱為死亡蛋白酶或細胞介素IB轉(zhuǎn)化酶（ICE），是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶[10-11]。Caspase介導的細胞凋亡的關鍵點的匯集是在Caspase-3上[12-14]。Caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的必需因子，是細胞凋亡的主要執(zhí)行者，亦是多種凋亡途徑的共同下游效應部分。Caspase-3以酶原的形式合成、存儲，只有在細胞凋亡的級聯(lián)反應中才被活化[15]。Caspase-3的活化是細胞凋亡的早期反應，在凋亡過程中起著重要作用。活化的Caspase-3可以破壞細胞內(nèi)多種蛋白酶復合體，激活核內(nèi)核酸酶，造成DNA損傷，從而導致細胞凋亡[16]。

胰腺外分泌腺泡萎縮，繼而由增生的纖維組織代之，是CP胰腺病理組織學改變的最主要表現(xiàn)，而胰腺腺泡的減少是胰腺纖維化的前提[17-20]。胰腺腺泡減少有兩種方式：壞死和凋亡[21]。人、鼠CP組織中均存在胰腺腺泡細胞凋亡現(xiàn)象[22]。因此，誘導胰腺腺泡細胞凋亡而導致胰腺實質(zhì)萎縮，是CP胰腺纖維化形成的主要機制之一。目前已知的兩條經(jīng)典的凋亡途徑是線粒體損傷途徑（內(nèi)源性途徑）和死亡受體活化途徑（外源性途徑）[23-25]。

本研究通過TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)模型組凋亡細胞面密度顯著高于空白組，說明CP胰腺中確實存在腺泡細胞的凋亡；同時免疫組織化學法及Western blot法檢測顯示模型組Caspase-3蛋白表達明顯上調(diào)，再次證實CP時大鼠體內(nèi)已啟動細胞凋亡。治療后胰泰復方中劑量組顯著優(yōu)于模型組，同時該組也下調(diào)了Caspase-3蛋白表達，提示胰泰復方可阻止Caspase-3的活化，從而阻止細胞凋亡，抑制CP胰腺纖維化的進程，這也說明胰泰復方延緩胰腺纖維化的機制可能是與減少胰腺腺泡細胞凋亡有關。此外，本研究將胰泰復方分為高、中、低三組，結(jié)果顯示中劑量即按正常成人與大鼠給藥劑量系數(shù)折算的劑量療效最佳。

CP的主要病機是本虛標實，本虛即脾虛，標實即氣滯血瘀。脾虛氣血生化無源，而致肝失濡養(yǎng)，肝疏泄不利，氣機郁滯則血瘀。本研究以健脾疏肝活血法為原則，在四君子湯和復元活血湯基礎上化裁而成胰泰復方。方中白術、人參、茯苓為君，健脾益氣；桃仁、柴胡、當歸為臣藥，疏肝活血止痛；佐以郁金、紅花、佛手理氣活血；使以炙甘草補氣、調(diào)和諸藥。諸藥合用，行健脾益氣、行氣活血之效。

本研究顯示，通過抑制胰腺腺泡細胞凋亡可能是胰泰復方防治CP胰腺纖維化的作用機制之一。

[參考文獻]

[1] 周翔宇，鄭英強，何雪梅.RIP1在急性胰腺炎胰腺腺泡細胞凋亡中的作用探討[J].重慶醫(yī)學，2016，45（21）：2894-2899.

[2] 石占利，孫靜，李志會，等.細胞凋亡在重癥急性胰腺炎并發(fā)急性肺損傷中的作用機制[J].解放軍醫(yī)學雜志，2017， 42（11）：974-978.

[3] 楊曉佳，王衛(wèi)星.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在胰腺炎發(fā)病機制中作用的研究進展[J].微循環(huán)學雜志，2016，26（4）：62-65.

[4] 張美鳳，金相任.腺泡細胞死亡方式對急性胰腺炎病情影響的研究現(xiàn)狀[J].世界華人消化雜志，2017，25（34）：3067-3071.

[5] 曾敏，楊帆.芍藥苷對大鼠急性胰腺炎的保護作用及相關機制研究[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志，2017，16（9）：841-844.

[6] 石占利，方堃，孫靜.大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺細胞凋亡的干預作用[J].中華全科醫(yī)學，2017，15（11）：1830-1834.

[7] Zhang Y，Yue D，Cheng L，et al. Vitamin A-coupled liposomes carrying TLR4-silencing shRNA induce apoptosis of pancreatic stellate cells and resolution of pancreatic fibrosis [J]. J Mol Med（Berl），2018，96（5）：445-458.

[8] Li Z，Zhu S，Huang L，et al. Exendin-4 impairs the autophagic flux to induce apoptosis in pancreatic acinar AR42J cells by down-regulating LAMP-2 [J]. Biochem Biophys Res Commun，2018，496（2）：294-301.

[9] Xiao X，Jones G，Sevilla WA，et al. A Carboxyl Ester Lipase（CEL）Mutant Causes Chronic Pancreatitis by Forming Intracellular Aggregates That Activate Apoptosis [J]. J Biol Chem，2016，291（44）：23224-23236.

[10] 賀偉.生長抑素治療急性胰腺炎對患者胰腺血流及胰腺功能的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（8）：92-95.

[11] 徐林芳，廖雯.生大黃對內(nèi)鏡下逆行胰膽管造影術后胰腺炎的預防作用[J].中國當代醫(yī)藥，2016，23（31）：21-23.

[12] 郇義超，趙佳.加味大承氣湯對急性胰腺炎模型大鼠血清炎癥因子及細胞凋亡的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2017， 26（7）：1152-1155.

[13] 陳軼，周景華，劉華生.胰泰復方對慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠NF-KB、IL-1影響的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2013，31（2）：244-246.

[14] 吳禮文，錢進，周清，等.血液灌流對急性胰腺炎伴高脂血癥患者血脂及炎性因子表達的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2016， 16（8）：1100-1101，1104.

[15] 鄭要初，祝志太，吳細明，等.大承氣湯在重癥急性胰腺炎治療中的作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（24）：152-155.

[16] 黃亨燁，施悅，陸丹妮，等.凋亡相關因子Caspase-3、Survivin在急性胰腺炎患者中的表達及意義[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志，2017，16（17）：1665-1668.

[17] Park JS，Yi TG，Park JM，et al. Therapeutic effects of mouse bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells in a mouse model of in- flammatory bowel disease [J]. J Clin Biochem Nutr，2015，57（3）：192-203.

[18] 蔡潮深.血必凈注射液聯(lián)合生長抑素治療重癥胰腺炎的臨床觀察[J].中國當代醫(yī)藥，2017，24（11）：41-44.

[19] 吳娟，張強.鄧明明.高脂血癥性急性胰腺炎大鼠胰腺組織NCX1、LC3Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3及Caspase-9蛋白表達觀察[J].山東醫(yī)藥，2016，56（39）：27-29.

[20] 蒲競，李汛，朱駿，等.PARP-1和caspase-3在胰腺癌及癌旁組織中的表達及意義[J].臨床肝膽病雜志，2016， 32（2）：337-341.

[21] 梅夏齊，汪云，王風秀，等.藏紅花對肝纖維化大鼠肝臟組織中Caspase-3，Bcl-2表達的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2016，16（23）：4427-4430.

[22] Liao D，Qian B，Zhang Y，et al. Inhibition of 5-lipoxygenase represses neutrophils activation and activates apoptosis in pancreatic tissues during acute necrotizing pancreatitis [J]. Biochem Biophys Res Commun，2018，498（1）：79-85.

[23] Liu MW，Wei R，Su MX，et al. Effects of Panax notoginseng saponins on severe acute pancreatitis through the regulation of mTOR/Akt and caspase-3 signaling pathway by upregulating miR-181b expression in rats [J]. BMC Complement Altern Med，2018，18（1）：51.

[24] Xie Q，F(xiàn)ei M，F(xiàn)a Z，et al. Methane-rich saline alleviates cerulein-induced acute pancreatitis by inhibiting inflammatory response，oxidative stress and pancreatic apoptosis in mice [J]. Int Immunopharmacol，2017，51：17-24.

[25] Cui L，Liu R，Li C，et al. Angiotensin-（1-7）attenuates caerulein-induced pancreatic acinar cell apoptosis [J]. Mol Med Rep，2017，16（3）：3455-3460.

（收稿日期：2018-03-08 本文編輯：張瑜杰）