陳映竹， 宋旭顥， 周闖， 張文博， 陳本平， 吳少彬， 岳碧松*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065； 2. 四川老君山國家級自然保護區(qū)，四川屏山645350； 3. 長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶408100)

綠翅短腳鵯Ixosmcclellandii隸屬于雀形目Passeriformes鵯科Pycnonotidae短腳鵯屬Ixos，主要分布于印度、中國、緬甸、越南、老撾、泰國和馬來半島等地，常棲息在海拔1 000～3 000 m的闊葉林、針闊葉混交林及次生林等，尤以林緣疏林和溝谷地帶較常見，主要以植物果實、種子和昆蟲為食(Moyle & Marks，2006；鄧青珊等，2008；丁虎林等，2013；鄭光美，2017)。盡管該物種較為常見且分布較廣，但與其相關(guān)的研究資料卻十分缺乏。

線粒體是生物體內(nèi)重要的細胞器，參與能量轉(zhuǎn)換、細胞凋亡等重要生理過程(Cleland & Youle，2011；Bessetal.，2012；Minetal.，2013)。線粒體基因組以其結(jié)構(gòu)簡單、進化速率快、分子量小、拷貝數(shù)高、不含內(nèi)含子、遺傳過程中不發(fā)生重組或倒位，以及嚴格遵守母系遺傳等特點，成為分子系統(tǒng)學(xué)和物種進化研究中的常用分子標記，在生物的起源演化以及種群遺傳學(xué)研究中被廣泛使用(Parmakelisetal.，2015；Lietal.，2017；Zhengetal.，2018)。在雀形目鳥類線粒體基因組中，控制區(qū)(control region， CR)的數(shù)量有2種情況，大多數(shù)鳥類線粒體基因組只有1個非編碼控制區(qū)，如綠背山雀Parusmonticolus(白潔，2012)、蒼頭燕雀Fringillacoelebs(Marshalletal.，2013)、鴉科Corvidae和椋鳥科Sturnidae(錢朝菊，2013)等。部分物種的線粒體基因組具有2個控制區(qū)，根據(jù)相似性又分為：1)控制區(qū)高度相似，如闊嘴鳥科Eurylaimidae(Mindelletal.，1998)、家燕Hirundorustica(陳娟，2015)、長尾山雀屬Aegithalos(Wangetal.，2015)和鵯科(Wen & Liao，2016)等；2)控制區(qū)高度異質(zhì)，如百靈科Alaudidae的云雀Alaudaarvensis(Elodieetal.，2011)等。本研究對綠翅短腳鵯線粒體基因組進行測序分析，為該物種的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和DNA提取

綠翅短腳鵯肌肉樣品采自四川老君山國家級自然保護區(qū)，利用試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司)提取線粒體基因組DNA。

1.2 引物設(shè)計及PCR擴增

線粒體基因組PCR擴增引物用Premier 5.0設(shè)計。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，選擇條帶明亮、清晰單一且長度一致的送成都擎科科技有限公司測序。測序結(jié)果峰圖文件首先在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行局部序列相似性搜索(BLAST)，以確定得到的測序結(jié)果為目的片段。得到的正確DNA序列數(shù)據(jù)用DNASTAR中的Editseq進行編輯處理。將拼接好的序列以Fasta格式輸出，利用SeqBuilder工具完成基因注釋。

2 結(jié)果

2.1 線粒體基因組結(jié)構(gòu)

綠翅短腳鵯線粒體基因組序列全長17 838 bp(GenBank登錄號：KX640824)，為一雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，包含37個編碼基因(22個tRNA基因、13個蛋白質(zhì)基因、2個rRNA基因)以及2個高度相似的控制區(qū)(CR1和CR2)(表1)。其中，除了8個tRNA基因和ND6基因在輕鏈上編碼外，其余都在重鏈上編碼。該線粒體基因組A、T、G、C的含量分別是27.81%、28.45%、25.36%和18.38%。

2.2 蛋白質(zhì)基因

在綠翅短腳鵯線粒體基因組中，部分基因間存在重疊或間隔現(xiàn)象，重疊長度一般為1～10 bp，間隔1～16 bp。其中，有2個重疊的開放閱讀框：ATP6和ATP8重疊了10 bp，ND4L和ND4重疊了7 bp。另外，還有一些重疊發(fā)生在蛋白質(zhì)基因和相鄰tRNA基因之間。除COX Ⅰ、ND3基因的起始密碼子分別為GTG、ATA外，其余蛋白質(zhì)基因的起始密碼子均為ATG，而終止密碼子則有6種，即TAA、TAG、AGG、ATA、TA和T(表1)。13個蛋白質(zhì)基因中，密碼子的組成及使用具有一定偏倚，使用頻率最高的密碼子為CUA(217次)和ACC(205次)，而GGU和GCG的使用頻率最低，均為24次(表2)。

2.3 tRNA和rRNA基因

綠翅短腳鵯線粒體基因組中，12S rRNA和16S rRNA位于tRNA-Phe基因與tRNA-Leu (UUR)基因之間，被tRNA-Val基因分隔開(表1)。tRNA基因分布在rRNA基因和蛋白質(zhì)基因之間，序列長度為64～75 bp。通過tRNAscan-SE 1.21(Lowe & Chan，2016)預(yù)測22個tRNA基因，結(jié)果顯示，除tRNA-Ser (AGY)基因在DHU臂上形成1個簡單的環(huán)，其他21個tRNA基因的二級結(jié)構(gòu)均為典型的三葉草形。

2.4 非編碼控制區(qū)

綠翅短腳鵯線粒體基因組的2個控制區(qū)(CR1和CR2)位于tRNA-Thr和tRNA-Phe基因之間，被tRNA-Pro、ND6和tRNA-Glu基因分隔開，長度分別為1 116 bp和1 144 bp。CR1與CR2相似度達91.6%，序列相同部分約1 000 bp，僅在兩端序列之間有所不同。2個控制區(qū)均可分為3個結(jié)構(gòu)域，即Domain Ⅰ、Domain Ⅱ及Domain Ⅲ(圖1)。Domain Ⅰ包含ETAS1元件和1個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，2個控制區(qū)中均未發(fā)現(xiàn)ETAS2元件。Domain Ⅱ中分布著6個保守序列元件，即F-box、E-box、D-box、C-box、Bird-box和B-box。Domain Ⅲ中只有1個保守元件CSB1，且上游存在1個插入片段。

3 討論

3.1 線粒體基因組分析

本研究中測定的綠翅短腳鵯線粒體基因組與已公布的部分雀形目鳥類(Chenetal.，2015)具有類似組成及結(jié)構(gòu)，即基因組為雙鏈閉合環(huán)狀的DNA分子，包含37個編碼基因和2個高度相似的控制區(qū)。線粒體基因組中，13個蛋白質(zhì)基因中相鄰的2個基因之間、一些蛋白質(zhì)基因和相鄰tRNA基因之間均存在堿基的重疊，這一特征說明了線粒體基因組的緊湊和精簡性(Curole & Kocher，1999；Kumaretal.，2015)。密碼子第三位上的堿基變異在蛋白質(zhì)基因中可以同義替換，即不會改變閱讀框所編碼的氨基酸(Choudhuryetal.，2017)。本研究結(jié)果顯示，同一個氨基酸同時有幾個密碼子，如編碼亮氨酸的密碼子有TTA、TTG、CTT、CTC、CTA和CTG等，均符合密碼子簡并性特點。第三位上的堿基變異在進化上的選擇壓力較小，堿基的偏倚性最能體現(xiàn)序列進化的變異特征。堿基含量中，A+T(56.26%)高于G+C(43.74%)。這一現(xiàn)象和多數(shù)脊椎動物線粒體基因組一致(Zhuangetal.，2013；孫利元等，2017；Zhangetal.，2018)。

3.2 控制區(qū)分析

控制區(qū)是線粒體中變異最大的區(qū)域，線粒體長度的變異也主要集中在控制區(qū)，大多數(shù)表現(xiàn)為堿基的缺失、插入和串聯(lián)重復(fù)序列的不同等，而控制區(qū)的主要功能是調(diào)控線粒體基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄(Mjelleetal.，2008；陳四海等，2011；Mikamietal.，2013；Tzur & Rosset，2015)。控制區(qū)作為線粒體最主要的非編碼區(qū)域，其堿基偏倚是反映線粒體基因組在進化歷程中變異積累的重要特征。它是整個線粒體基因組序列變異最大、堿基替換速率快、進化最快的一個區(qū)域，其序列差異可能是造成鳥類不同物種線粒體基因組序列差異的重要原因?？刂茀^(qū)序列已經(jīng)成為鳥類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究的一個重要分子標記(Keithetal.，2012；Schirtzingeretal.，2012；Songetal.，2014；章明等，2016)。

比較雀形目鳥類已有的線粒體基因組發(fā)現(xiàn)，控制區(qū)存在3種類型：1)常見于多數(shù)物種的單控制區(qū)；2)2個高度相似的控制區(qū)；3)2個異質(zhì)性很高的控制區(qū)。以本課題組測得的綠翅短腳鵯、金眶鹟鶯Seicercusburkii及棕腹大仙鹟Niltavadavidi線粒體基因組為代表加以闡述。

綠翅短腳鵯線粒體基因組的2個控制區(qū)可分為3個結(jié)構(gòu)域(Domain Ⅰ、Domain Ⅱ、Domain Ⅲ)，其相似度達91.6%，二者序列相同的部分約1 000 bp，僅在2個控制區(qū)開始部位約70 bp和存在于CR2末端約90 bp的序列有所不同，其余部分完全相似。2個控制區(qū)的存在可能是有利的或具有一定的功能性，因此，在某些情況下可以在進化過程中保留而不完全退化(Eberhardetal.，2001)。值得注意的是，本研究并未在2個控制區(qū)的Domain Ⅲ中發(fā)現(xiàn)對線粒體基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起始有重要作用的LSP/HSP元件，但在畫眉Garrulaxcanorus中則存在該結(jié)構(gòu)(Chenetal.，2015)。

表1 綠翅短腳鵯線粒體基因組特征Table 1 Characteristics of the mitochondrial genome of Ixos mcclellandii

注： L表示該基因位于輕鏈； 間隔區(qū)中的負數(shù)表示鄰近基因之間重合的堿基數(shù)

Note： “L” indicates that the gene is located in the light chain； negative numbers in the “intergenic nucleotide” indicate the number of overlapping bases between adjacent genes

表2 綠翅短腳鵯13個蛋白編碼基因的密碼子使用情況Table 2 Codon usage in the 13 protein-coding genes of Ixos mcclellandii mitogenome

圖1 綠翅短腳鵯線粒體控制區(qū)的結(jié)構(gòu)Fig. 1 The structure of 2 control regions (CR) in Ixos mcclellandii mtDNA

與綠翅短腳鵯相比，金眶鹟鶯的線粒體基因組含有2個異質(zhì)性很高的控制區(qū)，長度分別為1 127 bp和269 bp(未發(fā)表數(shù)據(jù))。盡管2個控制區(qū)也位于tRNA-Thr和tRNA-Phe基因之間，且同樣被tRNA-Pro、ND6和tRNA-Glu基因分隔，但控制區(qū)之間的相似度僅為16.6%。在CR1中，Domain Ⅰ分布著C-stretch、ETAS1-2及CSB1-like元件；Domain Ⅱ為中央保守區(qū)，主要分布有F-box、E-box、D-box、C-box、Bird-box和B-box元件；Domain Ⅲ主要分布有CSB1和LSP/HSP 2個保守元件。與綠翅短腳鵯線粒體基因組不同的是，在金眶鹟鶯的CR2中未能找到這些保守元件?；翌^鴉雀Paradoxornisgularis和云雀等物種線粒體具有與金眶鹟鶯類似的控制區(qū)結(jié)構(gòu)(Qianetal.，2013)。

棕腹大仙鹟線粒體基因組中只有1個控制區(qū)，位于tRNA-Thr和tRNA-Phe基因之間，長度為1 193 bp(未發(fā)表數(shù)據(jù))。在Domain Ⅰ中，分布著CSB1-like、ETAS1-2元件；Domain Ⅱ中分布有F-box、E-box、D-box、C-box、Bird-box和B-box元件；Domain Ⅲ中，分布著1個CSB1保守元件，下游有1段poly-T序列，這種控制區(qū)結(jié)構(gòu)與大多數(shù)鳥類線粒體基因組的控制區(qū)相同，如長尾山椒鳥Pericrocotusethologue、灰背伯勞Laniustephronotus、樹麻雀Passermontanus和黑枕黃鸝Orioluschinensis等(林立亮，2011；高瑞瑞，2013；錢朝菊，2013)。