孫 磊，李方暉

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長(zhǎng)期高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練對(duì)增齡大鼠骨骼肌脂聯(lián)素/AMPK信號(hào)途徑和細(xì)胞自噬的影響

孫 磊，李方暉

南京師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 210046

目的：探究8個(gè)月高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（HIIT）和持續(xù)性耐力訓(xùn)練（MICT）對(duì)增齡大鼠骨骼肌脂聯(lián)素/AMPK信號(hào)通路和細(xì)胞自噬的影響。方法：選取36只18月齡雌性清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為老齡安靜對(duì)照組（SED組）、老齡持續(xù)性耐力組（MICT組）和老齡高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練組（HIIT組），共3組，每組12只。MICT組以速度17 m/min進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練；HIIT組以起始速度為 15 m/min跑臺(tái)4 min，之后跑臺(tái)速度增至25 m/min跑臺(tái)1 min，依次交替進(jìn)行9個(gè)循環(huán)；兩個(gè)運(yùn)動(dòng)組跑臺(tái)時(shí)間均為45 min，每周5次，共8個(gè)月；SED組大鼠自由攝食但不進(jìn)行訓(xùn)練。在末次訓(xùn)練后48 h雙能X射線測(cè)試大鼠體成分。體成分測(cè)試后48 h依次測(cè)試各組大鼠張力、抓力、最大跑步速度和跑步力竭時(shí)間。比色法測(cè)定血清和腓腸肌丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶2（SOD2）活性；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定血清和腓腸肌4-羥基壬烯醛（4-HNE），8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）和胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）含量；ELISA測(cè)定血清和脂肪組織中脂聯(lián)素含量；蛋白免疫印跡法測(cè)定腓腸肌脂聯(lián)素、脂聯(lián)素受體1、去乙酰化酶3（SIRT3）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和自噬蛋白。結(jié)果：1）與SED和MICT組相比，HIIT組大鼠瘦體重%、體脂%、體脂與瘦體重比值%和抓力明顯增加；2）與SED組相比，MICT和HIIT組大鼠跑步力竭時(shí)間（＜0.01）、相對(duì)張力（＜0.05）和最大跑步速度（＜0.01）增加；3）與SED組相比，HIIT和MICT組等大鼠腓腸肌SOD2和IGF-1含量增加（＜0.01），血清IGF-1含量下降（＜0.01）；腓腸肌和血清4-HNE、8-OHdG低于SED組；4）HIIT組大鼠腓腸肌和血清MDA含量均低于MICT和SED組（＜0.01）；5）蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與SED組相比，HIIT組和MICT組大鼠脂聯(lián)素、脂聯(lián)素受體1、AMPK和SIRT3蛋白表達(dá)均顯著增加；6）與MICT組相比，HIIT組大鼠腓腸肌AMPK和脂聯(lián)素受體1蛋白表達(dá)增加（＜0.05）；7）HIIT組大鼠腓腸肌Beclin-1、LC3-I、LC3-II蛋白表達(dá)和LC3-II/LC3-I比值均高于SED組；相關(guān)性結(jié)果顯示，跑步力竭時(shí)間與腓腸肌脂聯(lián)素、脂聯(lián)素受體1、AMPK和LC3-II/LC3-I比值呈正相關(guān)。結(jié)論：長(zhǎng)期高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練可能通過(guò)IGF-1/SIRT3軸上調(diào)骨骼肌SOD2活性水平，防止骨骼肌氧化損傷；同時(shí)也可能通過(guò)激活脂聯(lián)素/AMPK信號(hào)途徑上調(diào)衰老骨骼肌自噬活性，從而可抵抗增齡大鼠肌肉質(zhì)量丟失，并改善大鼠運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。

高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練；增齡；骨骼??；脂聯(lián)素；自噬

前言

骨骼肌是人體進(jìn)行身體活動(dòng)的動(dòng)力源，具有一定的肌肉力量水平是人體進(jìn)行各種體力活動(dòng)的基礎(chǔ)；然而，隨著年齡增長(zhǎng)，人體的骨骼肌質(zhì)量、力量和耐力會(huì)出現(xiàn)下降，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，是老年人群中頻發(fā)的一種退行性疾病，稱(chēng)之為肌肉衰減征（Sarcopenia）[2]。肌肉衰減征會(huì)增加老年人衰老相關(guān)疾病的發(fā)病幾率，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量[15]。有研究已證實(shí)，衰老相關(guān)的氧化應(yīng)激是骨骼肌線粒體數(shù)量和機(jī)能下降的重要誘因，后者會(huì)增加肌細(xì)胞凋亡和肌纖維蛋白質(zhì)水解，造成肌纖維數(shù)量減少和肌纖維萎縮[20]，引起運(yùn)動(dòng)能力下降[33,35,47]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，衰老骨骼肌細(xì)胞自噬（Autophagy）活性降低會(huì)影響受損和功能異常的線粒體無(wú)法從整個(gè)線粒體網(wǎng)絡(luò)中清除，而功能異常的線粒體數(shù)目會(huì)增加呼吸鏈電子漏出的活性氧自由基（ROS）水平，進(jìn)而導(dǎo)致衰老骨骼肌細(xì)胞的線粒體氧化損傷和肌纖維蛋白的降解。提示，調(diào)控骨骼肌細(xì)胞自噬是緩解肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和保護(hù)衰老骨骼肌的有效策略[13]，但調(diào)控衰老骨骼肌自噬的具體機(jī)制尚不清楚。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase, AMPK）可通過(guò)調(diào)控哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin, mTOR）促進(jìn)細(xì)胞自噬[5]。作為一種增進(jìn)胰島素敏感性的脂肪因子，脂聯(lián)素（Adiponectin）能夠激活A(yù)MPK調(diào)控骨骼肌細(xì)胞自噬，改善肥胖大鼠骨骼肌胰島素敏感性和線粒體氧化代謝水平[49]；將肥胖小鼠骨骼肌脂聯(lián)素基因敲除后發(fā)現(xiàn)，小鼠骨骼肌氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)均顯著提高，補(bǔ)充脂聯(lián)素蛋白能經(jīng)骨骼肌脂聯(lián)素受體信號(hào)緩解骨骼肌氧化損傷[22]。Ren等[36]體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素/脂聯(lián)素受體（Adiponectin receptor）1信號(hào)可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞氧化損傷。Inoue等[19]研究也表明，運(yùn)動(dòng)通過(guò)調(diào)控脂聯(lián)素/脂聯(lián)素受體1/AMPK信號(hào)通路能緩解快速老化小鼠（SAMP10）骨骼肌氧化應(yīng)激水平，改善線粒體生物發(fā)生和抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡。提示，脂聯(lián)素/AMPK信號(hào)通路在改善衰老骨骼肌功能和維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)過(guò)程中扮演著重要角色。然而，細(xì)胞自噬是否參與脂聯(lián)素/AMPK信號(hào)軸對(duì)衰老骨骼肌起到保護(hù)效應(yīng)？

高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（High-intensity interval training, HIIT）被認(rèn)為是緩解肌肉衰減征更為有效的運(yùn)動(dòng)方式[38]。Bell等[9]研究發(fā)現(xiàn)，抗阻訓(xùn)練與HIIT刺激老年人肌纖維蛋白質(zhì)合成的效果相似，但HIIT對(duì)肌漿網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)合成的刺激效應(yīng)強(qiáng)于抗阻訓(xùn)練。Robinson等[38]研究也發(fā)現(xiàn)，與抗阻訓(xùn)練、耐力聯(lián)合抗阻練習(xí)相比，HIIT在提高老年人有氧適能、肌力、骨骼肌代謝功能方面效果更佳。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，HIIT在改變骨骼肌DNA表觀遺傳修飾調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，促進(jìn)骨骼肌功能蛋白表達(dá)和線粒體生物合成更有優(yōu)勢(shì)[38]。HIIT通過(guò)激活肥胖大鼠骨骼肌脂聯(lián)素/AMPK信號(hào)通路[31]和細(xì)胞自噬[27]，進(jìn)而改善骨骼肌線粒體氧化功能和收縮機(jī)能。但是，HIIT是否可通過(guò)脂聯(lián)素/AMPK信號(hào)通路調(diào)控自噬，降低衰老骨骼肌氧化應(yīng)激水平，抑制肌肉衰減征的發(fā)生？

基于此，本研究通過(guò)研究HIIT對(duì)18月齡增齡大鼠運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)、氧化應(yīng)激、脂聯(lián)素信號(hào)及其自噬蛋白表達(dá)的影響，探討HIIT對(duì)肌肉衰減癥的保護(hù)作用及分子機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依據(jù)我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生部提出的動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行管理和利用，并通過(guò)廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選用36只約18月齡清潔級(jí)Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK【粵】2013-0002）提供。所有大鼠采用自由攝食，廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物常規(guī)飼料及墊料。飼料供給量根據(jù)體重增長(zhǎng)相應(yīng)增加，每周更換墊料2～3次，溫度20℃～23℃，相對(duì)濕度50%～70%，自然光照，籠內(nèi)保持通風(fēng)干燥。

1.2 動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案

36只大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，之后進(jìn)行適應(yīng)跑臺(tái)1周，隨機(jī)分為3組，即老齡安靜對(duì)照組（SED組）、老齡持續(xù)性耐力組（MICT組）和老齡高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練組（HIIT組），每組12只。直至取材前共12只大鼠被排除：SED組2只（眼睛感染），MICT組4只（2只死于運(yùn)動(dòng)無(wú)關(guān)的原因、2只爪子外傷感染）和HIIT組6只（2只無(wú)法堅(jiān)持訓(xùn)練、2只爪子和2只尾部感染）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（型號(hào)：FD000043）購(gòu)置于廣州飛迪生物科技有限公司。適應(yīng)性訓(xùn)練后進(jìn)行正式訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)段為周一至周五的晚間18:30～22:00，周六、周日停訓(xùn)，共8個(gè)月。

1.3 體成分

避免最后一次運(yùn)動(dòng)帶來(lái)的急性影響，選擇在最后一次訓(xùn)練周期48 h后采用雙能X射線測(cè)試大鼠體成分。測(cè)試前腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉大鼠，將大鼠俯臥放置于XR-36NORLAND型雙能X線吸收平臺(tái)上（Unigamma X-ray Plus, Cerro Maggiore, Milano, Italy），在小動(dòng)物模式下掃描大鼠，觀察的指標(biāo)包括瘦體重、瘦體重百分比（瘦體重%）、體脂百分比（體脂%）、脂肪/瘦體重百分比（脂肪/瘦體重%）。

1.4 運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)

1.4.1 張力和抓力測(cè)試

運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的測(cè)試在體成分測(cè)試后48 h進(jìn)行，該時(shí)間間歇是為了減少麻醉對(duì)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的干擾。運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)測(cè)量包括跑步力竭時(shí)間（Exhaustion to time）、張力（Handing time）、抓力（Grip strength）和最大跑步速度（Maximum running speed）。抓力測(cè)試仿照Grip Strength Meter（Bioseb, France）使用拉力計(jì)和鐵絲網(wǎng)自制儀器，將儀器放置于光滑平面上，拉力計(jì)端保持固定，將大鼠放于鐵絲網(wǎng)上，沿鐵絲網(wǎng)的縱軸方向輕輕牽拉大鼠尾部，致其4個(gè)爪子抓緊鐵絲網(wǎng)，緩慢增加牽拉力度，直至拉力超過(guò)大鼠的抓力，大鼠被拉離鐵絲網(wǎng)。測(cè)試過(guò)程中，拉力計(jì)自動(dòng)記錄最大抓力值，重復(fù)測(cè)量3次，取最大值。以該參數(shù)與體重比值（N/g）×100用以評(píng)價(jià)抓力[27]。大鼠肌耐力測(cè)試參考Li等[27]采用改良斜板測(cè)試（Inclined plane test）方法。具體步驟：在大鼠尾部懸掛350 g重物，將其頭上尾下置于傾斜60°、距離地面50 cm高的鐵絲網(wǎng)（網(wǎng)眼規(guī)格1 cm×1 cm）上，鐵絲網(wǎng)下方放置泡沫墊以防大鼠摔傷，如果測(cè)試時(shí)間少于10 s，則休息 5 min再重新測(cè)試，最終記錄大鼠在鐵絲網(wǎng)上停留時(shí)間，該參數(shù)與體重（Body weight, BW）的比值（min/g）×100用以評(píng)價(jià)大鼠張力。

1.4.2 跑步力竭時(shí)間和最大跑步速度測(cè)定

18月齡大鼠采用遞增負(fù)荷在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)上進(jìn)行最大跑步速度測(cè)試，正式訓(xùn)練開(kāi)始前，HIIT組和MICT組大鼠在跑臺(tái)上進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，各組大鼠在末次訓(xùn)練后48 h進(jìn)行一次遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)。方案：進(jìn)行1 min跑臺(tái)熱身運(yùn)動(dòng)（速度20 cm/s）后，起始負(fù)荷設(shè)定為30 cm/s，之后，每 1 min跑步速度遞增5 cm/s，直至力竭。力竭判定標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)物跟不上預(yù)定速度，大鼠臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶后拖達(dá)30 s，毛刷刺激驅(qū)趕無(wú)效；行為特征為呼吸深急，精神疲倦，俯臥位垂頭，刺激后無(wú)反應(yīng)，最終記錄跑步力竭時(shí)間[27]。

適應(yīng)性訓(xùn)練后48 h進(jìn)行最大跑步速度測(cè)試，所有大鼠在跑臺(tái)上以20 cm/s的速度開(kāi)始跑，并以每1 min增加5 cm/s的速度遞增，直至大鼠疲勞，以大鼠無(wú)法維持一定速度，確定的最終跑臺(tái)速度作為大鼠最大跑步速度[11]。

1.5 取材

最大跑步速度測(cè)試結(jié)束后48 h，所有大鼠按照4 ml/kg劑量10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血；斷頸處死，將每只鼠的1.5 ml的混合肝素鈉的血液標(biāo)本存放于5 ml的EP管中，先常溫靜置30 min，最后在4℃環(huán)境下靜置1 h，緊接著進(jìn)行15 min離心，轉(zhuǎn)速在3 500 rpm離心之后，抽離血清，將剩余血清和血液分裝于凍存管中密封投入液氮后，迅速取出腓腸肌、股四頭肌、趾長(zhǎng)伸肌、比目魚(yú)肌稱(chēng)重，以每只大鼠不同骨骼肌質(zhì)量與體重的比值作為骨骼肌指數(shù)。紅色腓腸肌與人股外側(cè)肌相似，衰老過(guò)程呈現(xiàn)氧化應(yīng)激水平增加和線粒體功能失調(diào)[45]，因此，本研究分離紅色腓腸肌（深層）[7,39]組織作為衰老骨骼肌模型研究。分離出的紅色腓腸肌組織[45]和腎周脂肪（白色脂肪）[37]一部分用錫紙包裹分裝于－80 ℃冰箱保存。

1.6 氧化應(yīng)激參數(shù)和細(xì)胞因子測(cè)定

比色法測(cè)定腓腸肌和血清中丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量和超氧化物歧化酶2（Superoxide dismutase 2, SOD2）活性，單位分別為: nmol/L和 U/ml；腓腸肌和血清中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（Insulin-like growth factor 1,IGF-1）單位分別為：pg/mg和mg/dl；羥基壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal, 4-HNE）和8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-hydroxy-deoxyguanosine, 8-OHdG）單位分別為: ng/mg和ng/L。血清和腎周脂肪中脂聯(lián)素濃度均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行測(cè)定，單位分別為：mg/dl和pg/mg。試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，每個(gè)指標(biāo)測(cè)2次，取均值。

1.7 蛋白免疫印跡檢測(cè)骨骼肌相關(guān)蛋白表達(dá)

將上樣緩沖液與上述腓腸肌蛋白樣品等體積混合煮沸10 min。在垂直電泳儀上用相同體積的15 μg蛋白質(zhì)樣品分別經(jīng)6%、10%和15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）分離微管相關(guān)蛋白輕鏈3A/B（Microtubule-associated protein light chain 3 A/B, LC3A/B）、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、脂聯(lián)素、脂聯(lián)素受體1、去乙?；?（Sirtuin3, SIRT3）、AMPK和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, GAPDH）后轉(zhuǎn)移于聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，以1:1 000兔抗鼠一抗4℃靜置孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered solution, PBS）洗滌3次，再以1:1 000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（二抗）于37℃孵育1 h，洗滌后在暗室使用ECL試劑盒發(fā)光成像，Image J軟件讀取各條帶的灰度值，GAPDH為內(nèi)參蛋白。相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。上述抗體均購(gòu)置美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，Graph Pad Prism（Version 6.07）軟件作圖。以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示。對(duì)各組大鼠的所有指標(biāo)均采用單因素方差分析，事后多重比較（Post Hoc Tests）采用Tukey HSD法。采用Pearson相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)用表示。＜0.05和＜0.01分別表示顯著性意義和非常顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 各組增齡大鼠體成分和骨骼肌指數(shù)的變化

與SED組相比，HIIT組大鼠瘦體重%顯著增加15%（＜0.05，圖1B），體脂%顯著減少27%（＜0.05，圖1C）以及體脂/瘦體重%顯著降低43%（＜0.01，圖1D），HIIT組大鼠比目魚(yú)肌指數(shù)16%（＜0.01，圖1E）、腓腸肌指數(shù)18%（＜0.05，圖1F）和趾長(zhǎng)伸肌指數(shù)22%（＜0.05，圖1H）顯著增加，MICT組大鼠比目魚(yú)肌指數(shù)8%（＜0.05；圖1E）、腓腸肌指數(shù)22%（＜0.01，圖1F）和股四頭肌指數(shù)16%（＜0.05，圖1G）顯著增加。

2.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)增齡大鼠骨骼肌運(yùn)動(dòng)成績(jī)的影響

與SED組相比，HIIT和MICT組大鼠的跑步力竭時(shí)間（＜0.01，圖2A）、最大跑步速度（＜0.01，圖2D）和張力（＜0.05，圖2B）顯著增加。與SED（＜0.01）和MICT（＜0.05）組相比，HIIT組大鼠的相對(duì)抓力顯著增加（圖2C）。

圖 1 本研究各組大鼠體成分和骨骼肌指數(shù)的變化

Figure 1. Changes of Body Composition and Skeletal Muscle Index

注：*表示＜0.05，**表示＜0.01，下同。

圖2 各組大鼠力竭時(shí)間、張力、抓力和最大跑步速度的變化

Figure 2．Changes of Exhaustion to Time, Handing Time, Grasping Force and Maximum Running Speed

2.3 HIIT對(duì)增齡大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激的影響

與SED組相比，HIIT和MICT組大鼠腓腸肌SOD2活性（圖3D）和IGF-1蛋白含量（圖3E）顯著增加（＜0.01），血清中IGF-1含量（圖3J）顯著降低（＜0.01），HIIT組大鼠腓腸肌和血清4-HNE、8-OHdG和MDA顯著降低（＜0.01），MICT組大鼠4-HNE和8-OHdG顯著降低（＜0.01）。與MICT組相比，MDA顯著降低（＜0.01）。

圖3 各組大鼠腓腸肌和血清的氧化應(yīng)激指標(biāo)和IGF-1的變化

Figure 3. Changes of Oxidative Stress and IGF-1 in Gastrocnemius Muscle and Serum

2.4 HIIT對(duì)增齡大鼠骨骼肌自噬活性和相關(guān)蛋白表達(dá)的改變

與SED組相比，HIIT組大鼠腓腸肌Beclin-1（＜0.05）、LC3-I（＜0.05）、LC3-II（＜0.01）蛋白表達(dá)和LC3-II/LC3-I比值（＜0.05）顯著增加，MICT組大鼠Beclin-1（＜0.01）蛋白表達(dá)顯著增加。與MICT組相比，HIIT組大鼠LC3-II（＜0.01）蛋白表達(dá)顯著增加（圖4）。

圖4 腓腸肌自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

Figure 4. Expression of Autophagy Related Protein in Gastrocnemius Muscle

2.5 HIIT對(duì)增齡大鼠骨骼肌、脂肪和血清相關(guān)蛋白的改變

與SED組相比，HIIT組大鼠骨骼肌脂聯(lián)素顯著增加（＜0.01，圖5A），但血清中脂聯(lián)素顯著減少（＜0.05，圖5B），腎臟脂肪組織中無(wú)顯著差異（＞0.05，圖5C）。如圖5A所示，與SED組相比，HIIT組大鼠骨骼肌脂聯(lián)素受體1（＜0.01）、AMPK（＜0.01）和SIRT3（＜0.05）均顯著增加，MICT組大鼠骨骼肌脂聯(lián)素和SIRT3顯著增加（＜0.05）。與MICT相比，HIIT組大鼠骨骼肌脂聯(lián)素受體1和AMPK顯著增加（＜0.05）。

圖5 各組大鼠腓腸肌脂聯(lián)素、脂聯(lián)素受體1、SIRT3、AMPK及血清和腎周脂肪脂聯(lián)素變化

Figure 5. Changes of Adiponectin, Adiponectin receptor 1, SIRT3, and AMPK in Gastrocnemius and Adiponectin level in Serum and Adipose Tissue

2.6 相關(guān)性分析

如圖6所示，跑步力竭時(shí)間和最大跑步速度分別與8-OHdG蛋白含量呈負(fù)相關(guān)，而分別與脂聯(lián)素、脂聯(lián)素受體1、SIRT3、IGF-1、SOD2及Beclin-1蛋白含量和LC3-II/LC3-I比值呈正相關(guān)。8-OHdG與SOD2、IGF-1呈負(fù)相關(guān)（＜0.05）；SOD2與IGF-1（＜0.01）、SIRT3（＜0.05）、Beclin-1（＜0.01）和LC3-II/LC3-I 比值呈正相關(guān)。脂聯(lián)素與脂聯(lián)素受體1、AMPK、SIRT3、Beclin-1、LC3-II蛋白含量和LC3-II/LC3-I比值呈正相關(guān)。脂聯(lián)素受體1與AMPK、SIRT3、Beclin-1、LC3-I、LC3-II蛋白含量和LC3-II/LC3-I比值（0.05）呈正相關(guān)。AMPK與 LC3-I（＜0.05）、LC3-II（＜0.05）和LC3-II/LC3-I 比值呈正相關(guān)。SIRT3與Beclin-1（＜0.01）、LC3-II和LC3-II/LC3-I比值呈正相關(guān)。

圖6 各功能參數(shù)之間Pearson相關(guān)性分析熱圖

Figure 6. Heatmap Analysis of Pearson Correlation between Functional Parameters

注：各個(gè)參數(shù)Pearson相關(guān)系數(shù)值在熱圖方格中顯示。

3 討論

3.1 HIIT對(duì)增齡大鼠體成分、運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)和氧化應(yīng)激的影響

DEXA法用于評(píng)定老年人肌肉質(zhì)量衰減程度，再輔以握力、6 min步行、步速等6種身體活動(dòng)能力測(cè)試是對(duì)衰老骨骼肌功能和結(jié)構(gòu)的增齡性變化采用的常規(guī)方法[2]。本研究采用DEXA法對(duì)增齡大鼠體成分進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)大鼠抓力、張力、跑步力竭時(shí)間和最大跑步速度進(jìn)行測(cè)定[27]。如圖1所示，8個(gè)月HIIT能使增齡大鼠瘦體重%增加，體脂%、脂肪與瘦體重比值顯著降低，但MICT組大鼠體成分未發(fā)生明顯變化。與本研究結(jié)果一致的是，S?gaard等[43]也發(fā)現(xiàn)，6周HIIT能降低老年人內(nèi)臟脂肪和體脂%，并增加瘦體重占比。這提示，HIIT可抑制增齡過(guò)程中瘦體重向脂肪組織的轉(zhuǎn)化。綜上可知，相較于MICT，增齡大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期HIIT對(duì)改善體成分、緩解衰老肌纖維萎縮的效果更有效。

Robinson等[38]最新研究將HIIT與抗阻訓(xùn)練、耐力聯(lián)合抗阻訓(xùn)練對(duì)老年人肌肉衰減征的影響作比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIIT對(duì)提升老年人有氧耐力、肌力、骨骼肌代謝功能優(yōu)于其他兩種運(yùn)動(dòng)方式。本研究結(jié)果顯示，HIIT和MICT對(duì)改善大鼠跑步耐力的效果相似，但HIIT組大鼠抓力明顯高于MICT組，而MICT對(duì)增齡大鼠抓力無(wú)顯著影響（圖2）。這與Seldeen等[40]的研究結(jié)果一致，該研究顯示，16周HIIT能使增齡大鼠跑步力竭時(shí)間和抓力分別增加32.6%和10.9%。Bell等[9]進(jìn)一步證實(shí)，HIIT在增強(qiáng)老年人肌力方面優(yōu)于抗阻訓(xùn)練和MICT，可能與HIIT刺激肌漿網(wǎng)蛋白質(zhì)合成有關(guān)。綜上，HIIT在改善老年人有氧耐力的同時(shí)，也可緩解老年人肌纖維萎縮和肌力衰減，提示，HIIT兼具單純有氧訓(xùn)練和力量訓(xùn)練的疊加效應(yīng)。

氧化應(yīng)激在肌肉衰減征發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色[4,21]。衰老骨骼肌線粒體內(nèi)呼吸鏈電子漏出的ROS增加，將導(dǎo)致線粒體氧化損傷、肌纖維凋亡和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡。本研究通過(guò)測(cè)定大鼠骨骼肌SOD2活性及MDA、4-HNE和8-OHdG含量評(píng)價(jià)骨骼肌氧化應(yīng)激水平。SOD2作為線粒體抗氧化系統(tǒng)成員之一，可通過(guò)清除線粒體ROS減少脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷[8]。MDA和4-HNE可表征脂質(zhì)過(guò)氧化程度，其中，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物，4-HNE是脂質(zhì)氧化形成MDA的中間產(chǎn)物；8-OHdG是ROS直接損傷線粒體DNA片段，DNA鏈斷裂及堿基異常修飾形成的DNA氧化產(chǎn)物，是表征DNA氧化損傷水平的產(chǎn)物[21]。8-OHdG可誘導(dǎo)線粒體膜電位降低和線粒體凋亡通路活化，導(dǎo)致肌纖維數(shù)目減少和肌肉萎縮[10]。習(xí)慣性運(yùn)動(dòng)可抵抗衰老骨骼肌氧化應(yīng)激損傷[35]。但不同肌纖維類(lèi)型的抗氧化系統(tǒng)對(duì)不同運(yùn)動(dòng)方式的反應(yīng)和適應(yīng)呈現(xiàn)特異性[3]。李海鵬等[3]研究發(fā)現(xiàn)，21周負(fù)重爬梯和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)快速老化小鼠（SAMP8）腓腸肌和脛骨前肌的抗氧化酶活性均有增強(qiáng)作用，然而僅腓腸肌內(nèi)非酶類(lèi)抗氧化防御體系發(fā)生上調(diào)。說(shuō)明，衰老腓腸肌抗氧化系統(tǒng)對(duì)運(yùn)動(dòng)干預(yù)的適應(yīng)性更好[3]。本研究結(jié)果顯示，MICT組和HIIT組大鼠血清和腓腸肌4-HNE、8-OHdG含量低于SED組，且HIIT組大鼠腓腸肌MDA含量低于MICT組（圖3）。提示，盡管長(zhǎng)期MICT也能抑制增齡大鼠腓腸肌脂質(zhì)氧化和DNA氧化損傷，但HIIT維持衰老腓腸肌的氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡的效應(yīng)優(yōu)于MICT。鑒于腓腸肌抗氧化酶SOD2活性變化可推測(cè)，HIIT可能依賴非酶類(lèi)抗氧化防御體系或其他抗氧化酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)衰老腓腸肌氧化-抗氧化穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。本研究進(jìn)一步顯示，腓腸肌SOD2活性與跑步力竭時(shí)間和最大跑步速度均呈正相關(guān)，腓腸肌8-OHdG含量與力竭時(shí)間和最大跑步速度呈負(fù)相關(guān)（圖6），提示，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)延緩衰老骨骼肌形態(tài)和功能衰退可能與骨骼肌抗氧化系統(tǒng)功能增進(jìn)有關(guān)[4,21]。

3.2 HIIT對(duì)增齡大鼠骨骼肌細(xì)胞自噬活性的影響

細(xì)胞自噬作為骨骼肌必需的代償性內(nèi)置調(diào)節(jié)機(jī)制，參與骨骼肌線粒體質(zhì)量控制和線粒體代謝功能網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)的維持[6]。自噬體形成過(guò)程中，LC3-I需不斷形成LC3-II，進(jìn)而促進(jìn)自噬體膜的形成，當(dāng)自噬泡即將閉合時(shí)，只有膜結(jié)合形式的LC3-II能定位于自噬泡的膜上，故把LC3-II作為自噬體存在的標(biāo)志，而LC3-II/LC3-I比值可表征自噬活性水平[34]。此外，Beclin-1表達(dá)水平也被證實(shí)是自噬體形成的正向調(diào)控因子[5]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，衰老骨骼肌細(xì)胞自噬水平降低可導(dǎo)致線粒體質(zhì)量控制體系紊亂，功能異常的線粒體堆積，進(jìn)而引發(fā)呼吸鏈電子泄漏和ROS生成增加[25,30]。而適度上調(diào)自噬水平有利于降解衰老骨骼肌中功能異常的線粒體，維持骨骼肌能量代謝平衡[48]。

Luo等[30]研究發(fā)現(xiàn)，9周抗阻運(yùn)動(dòng)可提高增齡大鼠腓腸肌Beclin-1和LC3-II蛋白表達(dá)及LC3-II/LC3-I比值，進(jìn)而抑制腓腸肌氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡。本研究比較了MICT和HIIT兩種運(yùn)動(dòng)方式對(duì)增齡大鼠腓腸肌細(xì)胞自噬的影響（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIIT組大鼠腓腸肌Beclin-1、LC3-I、LC3-II蛋白表達(dá)及LC3-II/LC3-I比值均增加，但MICT組大鼠腓腸肌僅Beclin-1蛋白表達(dá)增加，LC3-II蛋白表達(dá)稍有增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Kim等[25]的研究結(jié)果一致。提示，與MICT相比，HIIT中的短時(shí)間大強(qiáng)度訓(xùn)練對(duì)于提高骨骼肌自噬活性尤為重要[27,28]。Li等[27,28]也比較HIIT和MICT對(duì)青年大鼠不同肌纖維類(lèi)型自噬活性的影響。結(jié)果表明，HIIT能提高比目魚(yú)肌和心肌的自噬活性，但對(duì)股外側(cè)肌自噬活性沒(méi)有影響，而MICT對(duì)上述3種肌肉類(lèi)型的細(xì)胞自噬無(wú)顯著影響[27,28]。提示，骨骼肌自噬適應(yīng)性改變與肌纖維類(lèi)型及運(yùn)動(dòng)方式均有關(guān)。然而，HIIT對(duì)增齡大鼠不同肌纖維類(lèi)型細(xì)胞自噬的影響仍需進(jìn)一步研究。本研究也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，腓腸肌LC3-II/LC3-I比值與8-OHdG含量呈負(fù)相關(guān)，但與跑步力竭時(shí)間、最大跑步速度及腓腸肌SOD2活性呈正相關(guān)（圖6），提示，增強(qiáng)自噬活性有利于降低衰老腓腸肌過(guò)度的氧化應(yīng)激水平，抵抗肌纖維萎縮，進(jìn)而改善大鼠運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。

3.3 HIIT對(duì)增齡大鼠骨骼肌脂聯(lián)素/AMPK信號(hào)途徑和IGF-1/SIRT3軸的影響

脂聯(lián)素因其具有改善骨骼肌細(xì)胞自噬、增強(qiáng)骨骼肌抗氧化能力和線粒體氧化代謝等功能而備受關(guān)注[12]。橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，健康老年人骨骼肌脂聯(lián)素敏感性降低將會(huì)導(dǎo)致血清脂聯(lián)素濃度增加，后者與肌肉力量和有氧適能水平衰減有關(guān)[23]。細(xì)胞模型也表明，骨骼肌脂聯(lián)素抵抗可誘導(dǎo)肌細(xì)胞線粒體功能紊亂和氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致肌細(xì)胞萎縮[41,46]。骨骼肌脂聯(lián)素抵抗與肌細(xì)胞膜上脂聯(lián)素受體1蛋白表達(dá)及其下游信號(hào)分子AMPK活性降低有關(guān)[41]。有研究已證實(shí)，脂聯(lián)素/脂聯(lián)素受體1可通過(guò)激活A(yù)MPK誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞自噬[14]，進(jìn)而抑制快速老化小鼠骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡[19]。圖5顯示，HIIT和MICT組大鼠血清脂聯(lián)素濃度降低，腓腸肌脂聯(lián)素蛋白表達(dá)增加，但只有HIIT組大鼠腓腸肌脂聯(lián)素受體1和AMPK蛋白表達(dá)增加。提示，HIIT對(duì)于刺激增齡大鼠骨骼肌脂聯(lián)素受體1/AMPK信號(hào)通路活化的作用強(qiáng)于MICT。肥胖大鼠模型研究也證實(shí)，HIIT能上調(diào)肥胖大鼠骨骼肌脂聯(lián)素和脂聯(lián)素受體1蛋白及激活下游的AMPK信號(hào)通路，進(jìn)而改善肥胖大鼠骨骼肌氧化代謝水平和運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)[31]。本研究結(jié)果也顯示，增齡大鼠腓腸肌脂聯(lián)素（=0.80）和脂聯(lián)素受體1蛋白表達(dá)（=0.63）與跑步力竭時(shí)間呈正相關(guān)（圖6）。這也間接說(shuō)明，激活衰老骨骼肌脂聯(lián)素信號(hào)通路可能與大鼠耐力表現(xiàn)改善有關(guān)。同時(shí)，腓腸肌AMPK與脂聯(lián)素（=0.55）和脂聯(lián)素受體1（=0.61）蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，LC3-II/LC3-I比值與脂聯(lián)素（=0.65）、脂聯(lián)素受體1（=0.67）和AMPK（=0.51）也呈正相關(guān)（圖6），由此推測(cè)，腓腸肌脂聯(lián)素/AMPK信號(hào)途徑可能參與對(duì)自噬活性的正向調(diào)控作用。然而，該途徑是否介導(dǎo)HIIT對(duì)衰老骨骼肌自噬的調(diào)節(jié)作用仍需基因修飾動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的直接證實(shí)。

作為依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶組蛋白去乙?；讣易宄蓡T之一，SIRT3主要通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體抗氧化酶活性和細(xì)胞自噬來(lái)維持線粒體穩(wěn)態(tài)[1]。骨骼肌特異性過(guò)表達(dá)SIRT3可促進(jìn)慢肌纖維轉(zhuǎn)換和線粒體氧化代謝酶表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠有氧耐力[29]。但衰老進(jìn)程中骨骼肌SIRT3活性和蛋白表達(dá)減少將導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力衰減和線粒體功能失調(diào)[17,26]。運(yùn)動(dòng)可使老年人骨骼肌SIRT3蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而加速衰老骨骼肌線粒體生物合成速率[26]。本研究結(jié)果顯示，HIIT組和MICT組大鼠腓腸肌SIRT3蛋白表達(dá)增加（圖5），且SIRT3蛋白表達(dá)與跑步力竭時(shí)間（=0.76）和最大跑步速度（=0.77）呈正相關(guān)（圖6）。提示，HIIT和MICT抵抗腓腸肌肌纖維萎縮和增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力可能與腓腸肌SIRT3蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。骨骼肌胰島素抵抗細(xì)胞模型研究證實(shí)，SIRT3介導(dǎo)AMPK對(duì)骨骼肌細(xì)胞自噬的正向調(diào)控過(guò)程[42]。本研究結(jié)果也顯示，腓腸肌SIRT3與Beclin-1、LC3-II和LC3-II/LC3-I比值呈正相關(guān)（圖6），說(shuō)明，SIRT3也可能介導(dǎo)AMPK正向調(diào)控衰老骨骼肌自噬活性。綜上，HIIT可通過(guò)脂聯(lián)素/脂聯(lián)素受體1/AMPK/SIRT3信號(hào)途徑調(diào)節(jié)腓腸肌細(xì)胞自噬活性（圖7）。

圖7 HIIT調(diào)控骨骼肌腓腸肌脂聯(lián)素/AMPK信號(hào)途徑和自噬的可能機(jī)制

Figure 7. Schematic of Relevant Mechanisms in HIIT Regulated Adiponectin/AMPK Signaling and Autophagy

注：紅色箭頭表示HIIT調(diào)節(jié)作用；綠色箭頭表示MICT調(diào)節(jié)作用，黑色箭頭表示該蛋白表達(dá)上調(diào)。

Luo等[30]發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠腓腸肌IGF-1自分泌降低與肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和肌細(xì)胞凋亡率增加有關(guān)。細(xì)胞模型證實(shí)，IGF-1能增強(qiáng)肌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力[50]。抗阻運(yùn)動(dòng)和自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)能增加老齡大鼠腓腸肌中IGF-1蛋白表達(dá)，進(jìn)而提升腓腸肌抗氧化活性并降低氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)衰老骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能[24,30]。本研究通過(guò)比較MICT和HIIT對(duì)衰老腓腸肌IGF-1自分泌的影響，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，與SIRT3和SOD2相似，MICT和HIIT可同等程度地促進(jìn)衰老腓腸肌分泌IGF-1（圖3E）。這與Mu?oz等[32]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)通過(guò)促進(jìn)衰老大鼠大腦黑質(zhì)神經(jīng)元SIRT3和IGF-1蛋白表達(dá)，降低多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷。文獻(xiàn)證實(shí)，骨骼肌自分泌IGF-1可通過(guò)激活PI3K/Akt/PGC-1α信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)骨骼肌SIRT3蛋白表達(dá)[16,44]，后者可提升線粒體SOD2活性和蛋白表達(dá)。圖6顯示，腓腸肌IGF-1與SIRT3蛋白含量（=0.60）和SOD2活性（=0.85）呈正相關(guān)。推測(cè)，HIIT和MICT可能通過(guò)激活I(lǐng)GF-1/SIRT3軸提高腓腸肌SOD2活性，進(jìn)而降低脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA氧化損傷。然而，骨骼肌自分泌IGF-1調(diào)控SIRT3蛋白表達(dá)及其具體機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練可能通過(guò)IGF-1/SIRT3軸上調(diào)骨骼肌SOD2活性水平，防止骨骼肌氧化損傷，同時(shí)也可能通過(guò)激活脂聯(lián)素/AMPK信號(hào)途徑上調(diào)衰老骨骼肌自噬活性，從而可抵抗增齡大鼠肌肉質(zhì)量丟失，并改善大鼠運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。

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Effects of Long-term High-intensity Interval Training on Adiponectin/AMPK Signaling Pathway and Autophagyin Skeletal Muscle of Aged Rats

SUN Lei, LI Fang-hui

Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China.

Objective:To investigate the effects of 8-month high-intensive intervel training (HIIT) and moderate-intensity continuous training (MICT) on adiponectin/AMPK pathway and autophagy in skeletal muscle of aged rats. Methods: 36 female Sprague Dawley rats at 18 months old were selected randomly and divided into three groups: sedentary control (SED), moderate-intensity continuous training (MICT), and high-intensity intervel training group (HIIT), 12 rats per group. HIIT consisted of 9 intervals of 5-minute running on treadmill (1 minutes at 25 m/min and 4 minutes at 15 m/min), MICT consisted of 45 min of continuous exercise at a moderate intensity (17 m/min) per day, 5 times per week for 8 months, SED group were fed freely but not trained.The body composition was measured by dual-energy X-ray at 48 h after the last training. Handing time, grip strength, maximum running speed, and exhaustion to time were measured 48 h after body composition test. Malonylaldehyde (MDA) and superoxide dismutase 2 (SOD2) levels of gastrocnemius were measured, and levels of 4-hydroxynonenal (4-HNE), 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG), and insulin-like growth factor 1 (IGF-1) of gastrocnemius were assessed using ELISA. Western blotting was used to evaluate the protein expression of adiponectin, adiponectin receptor 1, sirtuin 3 (SIRT3), adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase (AMPK), and autophagy (Beclin-1, LC3-I, LC3-II). Results: Compared with the SED and MICT groups, the percent lean, the percent body fat, and body fat to lean mass ratio of HIIT group were significantly increased. HIIT resulted in a larger improvement in grip strength related to MICT group, with similar increase in inclined plane performance, maximum running speed, and exhaustion to time as compared with the SED group. The protein expression of SOD2 and IGF-1 in the gastrocnemius significantly increased, while the serum IGF-1 levels significantly decreased in both HIIT and MICT groups when compared with the SED group (P＜0.01). The gastrocnemius and serum levels of 4-HNE and 8-OHdG in the HIIT and MICT groups were lower than those in SED group. Gastrocnemius and serum MDA levels in HIIT group were lower than those in MICT and SED groups (P＜0.01). HIIT group showed a significant elevation in adiponectin, adiponectin receptor 1, AMPK, and SIRT3 protein content as compared with the SED group. HIIT group experienced higher protein expression of AMPK and adiponectin receptor 1 compared with the MICT group (P＜0.05). Additionally, HIIT group showed a significant elevation of Beclin-1, LC3-I, LC3-II protein expression, and LC3-II/LC3-I ratio compared with the SED group. Correlation analysis showed that exhaustion to time were positive with adiponectin, adiponectin receptor 1, AMPK, and LC3-II/LC3-I ratio, respectively. Conclusions: Long-term high-intensity intervel training upregulate the SOD2 activity may be via IGF-1/SIRT3 axis, preventing skeletal muscle oxidative stress, furthermore, it may also upregulate the autophagic activity by activiting adiponectin/AMPK pathway, attenuating the loss of muscle mass and improving the physical performance in aged rats model.

G804.7

A

1000-677X(2018)11-0050-10

10.16469/j.css.201811005

2018-09-13；

2018-11-02

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31500961); 廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020220015); 江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)資助項(xiàng)目(18KJB180011)。

孫磊,男,在讀碩士研究生,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與抗衰老,E-mail: slyouknow@163.com。

李方暉,男,副教授,博士,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)抗衰老機(jī)制研究,E-mail: 12356@njnu.edu.cn。