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瘧疾是由瘧原蟲引起的一種蟲媒寄生蟲病，是世界上危害最嚴重的熱帶病之一。寄生于人體的瘧原蟲有5種，即間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)、惡性瘧原蟲(P.falciparum)、三日瘧原蟲(P.malariae)、卵形瘧原蟲(P.ovale)和諾氏瘧原蟲(P.knowlesi)。隨著全國瘧疾消除計劃的有效推進，目前國內(nèi)本地感染病例大幅下降，但由于國際交往及勞務輸出人員的日益增加，由此帶來的輸入性瘧疾病例卻有逐年增加的態(tài)勢[1]。2015年全國輸入性瘧疾病例數(shù)為3 248例，較2014年(3 021例)增加了7.5%，其中，山東省212例，全部為輸入性病例，較2014年(150例)增加了41.3%[2]。

山東省輸入性病例主要為惡性瘧，間日瘧次之，偶見卵形瘧和三日瘧[3]。根據(jù)全國瘧疾消除計劃，每個瘧疾病例必須通過省級鏡檢復核、聚合酶鏈式反應(PCR)符合。巢式PCR系統(tǒng)由Snounou在1993年(NP-1993)開發(fā)并在各省瘧疾診斷參比實驗室中推廣[4]。2012-2013年，遼寧、海南、貴州、河南、上海和浙江等省(市)先后出現(xiàn)自非洲輸入的若干特殊瘧疾病例，其鏡檢結(jié)果為卵形瘧原蟲，但瘧疾快速檢測試劑盒(RDT)或NP-1993常規(guī)巢式PCR檢測結(jié)果卻呈陰性，部分樣本被送至國家瘧疾診斷參比實驗室進行復核鑒定，結(jié)果顯示這些病例感染的是卵形瘧原蟲wallikeri亞種(P.ovalewallikeri)，而非curtisi亞種(P.ovalecurtisi)，而NP-1993 檢測體系僅對curtisi亞種敏感[5]。

P.ovalecurtisi和P.ovalewallikeri兩個亞種最初被命名為CDC-type 和LS-type，是1995年Li等[6]發(fā)現(xiàn)的，這兩種卵形瘧原蟲SSU rRNA的序列同源性僅為91.5%。隨后，陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，P.ovalecurtisi和P.ovalewallikeri在動合子表面蛋白基因、細胞色素B基因、絲氨酸蛋白基因、核糖體基因、線粒體基因、核基因、以及蚊體內(nèi)發(fā)育所必需的基因均有差異，因此，最終將經(jīng)典型P.ovale定義為curtisi，將變異型P.ovale定義為wallikeri[7-9]?，F(xiàn)將山東省14例輸入性P.ovalewallikeri亞種實驗室鑒定分析結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1樣本來源 14例樣本均為山東基層疾病預防控制中心(CDC)或醫(yī)療機構(gòu)上報的瘧疾病例抗凝全血。陰性對照血樣為本單位職工健康體檢者的抗凝全血。采集血樣和進行流行病學調(diào)查的所有病例均獲得患者本人及家屬的知情同意。

1.2主要試劑 QIAamp DNA Mini Kit(德國Qiagen公司)；2×Taq PCR StarMix(北京GenStar公司)；DNA marker(日本Takara公司)。

1.3血涂片厚薄血膜鏡檢 采集患者抗凝全血或末梢血制作帶有厚薄血膜的標準血涂片，干燥，固定后行吉氏染色，油鏡下鏡檢瘧原蟲。

1.4RDT檢測 參照說明書對14例患者血樣進行RDT檢測。取5 μL全血，垂直加入檢測卡上加樣孔A內(nèi)，然后在樣品孔B上垂直滴加4滴裂解液，15 min內(nèi)判讀結(jié)果。

1.5瘧原蟲DNA的提取 按照QIAamp DNA Mini Kit說明書提取瘧原蟲基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6NP-1993常規(guī)巢式PCR擴增 以提取的瘧原蟲DNA為模板，進行常規(guī)巢式PCR擴增[3-4]。首先，使用瘧原蟲屬特異性引物rPLU5/rPLU6進行第1輪擴增；然后以第1輪產(chǎn)物為模板，分別使用rFAL1/rFAL2(惡性瘧原蟲)、rVIV1/rVIV2(間日瘧原蟲)、rMAL1/rMAL2(三日瘧原蟲)和rOVA1/rOVA2(卵形瘧原蟲)進行第2輪擴增，產(chǎn)物預期大小應分別為205 bp、120 bp、144 bp、800 bp。

1.7p.ovalewallikeri亞種的PCR檢測 以提取的瘧原蟲DNA為模板，引物rPLU1：5′-CCCTACTACTTGATGGTCCTCA-3′和rPLU5：5′-TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA-3′進行第一輪擴增，以第一輪產(chǎn)物為模板，分別以rOVA1WC：5′-TGTAGTATTCAAACGCAGT-3′和rOVA2WC：5′-TATGTACTTGTTAAGCCTTT-3′，預期產(chǎn)物應為660 bp，此輪擴增可同時檢測P.ovalecurtisi和P.ovalewallikeri兩個亞種；以rOVA1v：5′-ATCTCCTTTACTTTTTGTACTGGAGA-3′和rOVA2v：5′-GGAAAAGGACACTATAATGTATCCTAATA-3′為引物，預期產(chǎn)物應為780 bp，此輪擴增檢測卵形瘧原蟲P.ovalewallikeri亞種。PCR反應體系：2×PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，剩余用ddH2O補足至25 μL。

2 結(jié) 果

2.1血涂片厚薄血膜鏡檢結(jié)果 14例山東省網(wǎng)報卵形瘧病例經(jīng)基層疾控中心或醫(yī)療機構(gòu)鏡檢的初檢結(jié)果：11例卵形瘧，3例間日瘧；山東省瘧疾診斷參比實驗室鏡檢的復檢結(jié)果：13例卵形瘧，1例間日瘧。

大多數(shù)病例顯微鏡下卵形瘧原蟲形態(tài)較典型，少數(shù)在國外多次不規(guī)范用藥病例的瘧原蟲形態(tài)不典型，不易與三日瘧和間日瘧原蟲相區(qū)別。油鏡下可見薄血膜中感染原蟲的紅細胞變形明顯，未脹大或略脹大，呈橢圓形、帶毛刺、傘矢狀、拖尾、水滴狀等多種不規(guī)則形狀，紅細胞邊緣多呈鋸齒狀、凹凸不齊；厚薄血膜中環(huán)狀體、大滋養(yǎng)體、裂殖體(成熟、未成熟)及配子體(雌、雄)等多期卵形瘧原蟲均有所見，大滋養(yǎng)體、裂殖體居多，晚期環(huán)狀體比早期典型環(huán)狀體偏多，配子體較少。14例患者薄血膜中的環(huán)狀體含1個紅色核，胞漿較粗厚；大滋養(yǎng)體多含1個較粗大紅色核(多個病例見到2個核的情況)，不規(guī)則阿米巴樣藍色胞漿，空泡多明顯、常見較大黃棕色瘧色素顆粒；裂殖體略大于正常紅細胞，多含6～10個裂殖子，多數(shù)與聚集中間的瘧色素塊一起，形似“菊花狀”；配子體典型，較大，多含散在、粗大棕黃色瘧色素，核周淡染帶明顯。裂殖體、配子體含瘧色素相對較多。厚血膜原蟲數(shù)量較多，形態(tài)較典型，但與三日瘧和間日瘧原蟲很難鑒別，見圖1。

a、b：環(huán)狀體；c、d：晚期環(huán)狀體；e、f：大滋養(yǎng)體；g、h：未成熟裂殖體；i、j：裂殖體；k、l：雌配子體；m-p：大滋養(yǎng)體、未成熟裂殖體、裂殖體；a-l薄血膜；m-p厚血膜圖1 部分P.ovale wallikeri亞種卵形瘧原蟲的鏡下形態(tài)Fig.1 Microscopic structure characteristics of P.ovale wallikeri

2.2RDT結(jié)果 14份血樣利用瘧疾快速診斷試紙條進行檢測，其中，12例血樣為質(zhì)控和T2出現(xiàn)反應線，提示為間日瘧、卵形瘧、三日瘧單一感染或混合感染；2例血樣僅出現(xiàn)質(zhì)控反應線，結(jié)果為陰性。

2.2NP-1993常規(guī)巢式PCR結(jié)果 利用NP-1993常規(guī)巢式PCR對14份血樣進行惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲的檢測，PCR結(jié)果均為陰性，部分結(jié)果見圖2。

2.3P.ovalewallikerii亞種的PCR檢測結(jié)果 采用改進引物進行P.ovalewallikeri亞種的PCR檢測，14份血樣在第二輪PCR擴增中，分別得到660 bp和780 bp的條帶，而P.ovalecurtisi僅得到660 bp的條帶，與預期結(jié)果一致，見圖3。測序后經(jīng)Blast比對，14份血樣均為P.ovalewallikeri亞種感染。

M: DNA標志物；1：P.ovale curtisi陽性對照；2-5：5例樣本分別用NP-1993體系中的卵形瘧原蟲引物、惡性瘧原蟲引物、三日瘧原蟲引物和間日瘧原蟲引物檢測結(jié)果；6：陰性對照圖2 部分瘧疾病例NP-1993常規(guī)巢式PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR product of partial cases by NP-1993 conventional nested PCR

3 討 論

自2012年山東省首次發(fā)現(xiàn)輸入性卵形瘧病例以來，隨著勞務輸出的人數(shù)增加，輸入性卵形瘧病例有上升趨勢[3]。本研究中的14例卵形瘧原蟲wallikeri亞種感染患者，均有外出務工或者旅游的境外居留史，且前往的國家(莫桑比克、科特迪瓦、喀麥隆、赤道幾內(nèi)亞、剛果、安哥拉)均為瘧疾重度流行區(qū)(非洲)。

瘧原蟲的蟲種鑒定是瘧疾控制或消除的關鍵步驟之一，對進一步的規(guī)范化治療和精準防控至關重要。瘧疾診斷主要有血涂片顯微鏡檢，RDT和PCR三種常規(guī)方法。血液中原蟲密度低、混合感染、患者多次不規(guī)范服藥等均可造成瘧原蟲形態(tài)發(fā)生變化，無疑會增加鏡檢鑒別蟲種的難度，從而造成誤診和漏診[10]。同時，由于卵形瘧原蟲在形態(tài)上和三日瘧原蟲、間日瘧原蟲相似，鏡檢時容易誤判。本研究14例卵形瘧原蟲wallikeri亞種病例中，基層初檢時3例誤診為間日瘧原蟲，因此，僅通過鏡檢進行瘧原蟲分類在方法學上不夠嚴謹。

RDT法的優(yōu)點是簡便直觀，由于缺少除惡性瘧原蟲以外的針對其他瘧原蟲的單一特異RDT檢測試劑，因此，RDT檢測僅能區(qū)分惡性瘧原蟲感染和非惡性瘧的泛瘧原蟲感染[10]。同時，由于RDT受檢測試劑敏感性的限制，也曾出現(xiàn)誤診陰性的病例。本研究中，就出現(xiàn)了2例RDT陰性誤診。

NP-1993常規(guī)巢式PCR的發(fā)明，極大彌補了RDT法不能有效區(qū)分四種瘧原蟲的缺憾。隨著瘧原蟲基因變異的發(fā)生發(fā)展，NP-1993體系已經(jīng)不能滿足區(qū)分卵形瘧原蟲curtisi和wallikeri兩個亞種的需要。因此，用于檢測卵形瘧原蟲wallikeri亞種的引物應運而生。本研究應用的rOVA1WC/rOVA2WC能同時擴增卵形瘧原蟲curtisi和wallikeri亞種而產(chǎn)生660 bp的陽性條帶，而rOVA1v/rOVA2v僅能擴增卵形瘧原蟲wallikeri亞種產(chǎn)生780 bp的陽性條帶，因此，能有效區(qū)分卵形瘧原蟲curtisi和wallikeri亞種。

M: DNA標志物；1-14：1-14例樣本；15：P.ovale curtisi對照；16：陰性對照圖3 14例P.ovale wallikeri亞種的PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR result of P.ovale wallikeri with 14 malaria cases

2010年，中國政府啟動了全國瘧疾消除計劃(NMEP)，旨在到2020年在全國范圍內(nèi)消除瘧疾[11]。自2011年山東省出現(xiàn)最后一例瘧疾本地感染病例以來，至2017年底，已經(jīng)連續(xù)6年無本地感染病例，而輸入性病例的增加以及基因變異類型瘧原蟲病例的出現(xiàn)，無疑給醫(yī)療工作者帶來了新的挑戰(zhàn)。因此，研發(fā)適用于變異型瘧原蟲的診斷試劑和檢測技術，有利于特殊病例的及早發(fā)現(xiàn)和精準治療，是對NMEP有效推進的技術保障。