孔 瑞，尹 佳

哮喘是一個從病因到病理機制都很復雜的疾病，其最明顯的特征是可逆的氣道阻塞，氣道高反應性和氣道炎癥。過敏是誘發(fā)哮喘的重要因素。動物模型是研究哮喘發(fā)病機制的一個重要手段。動物模型研究中一個很大的挑戰(zhàn)是如何誘導出最接近人類的哮喘表型。早期，人們嘗試用平滑肌激動劑如乙酰膽堿或組胺激發(fā)的方式誘導各種動物出現(xiàn)氣道平滑肌痙攣，表現(xiàn)為氣道高反應性(airway hyperresponsiveness，AHR)，隨著研究的進展，越來越多研究者開始使用環(huán)境中的變應原如塵螨、花粉等對動物模型進行致敏和激發(fā)，從而誘導出更接近人類表型的哮喘模型。本文就動物模型中過敏性哮喘相關的免疫應答、動物的選擇、技術路線、肺功能測定方法和白介素家族細胞因子表達變化等內(nèi)容進行綜述。

1 哮喘相關的免疫應答

輔助性T細胞(T helper cell，Th)在過敏性哮喘患者體內(nèi)免疫應答中發(fā)揮重要作用。天然CD4+T細胞可以分化為不同的Th細胞亞群，比如Th1，Th2，Th17細胞。IL-12是最主要的Th1型細胞因子， IFN-γ為其下游因子，是Th1型免疫應答的主要執(zhí)行因子[1]。參與Th1型免疫應答的主要細胞包括巨噬細胞和產(chǎn)IgG的B細胞等，IgG在過敏性哮喘變應原特異性免疫治療過程中發(fā)揮重要作用。Th2參與宿主對細胞外病原體的防御反應，通過分泌IL-4，IL-5和IL-13參與免疫反應[1]。參與Th2型免疫應答的主要細胞包括肥大細胞、嗜酸細胞、嗜堿細胞和產(chǎn)IgE的B細胞等，以上細胞均是參與過敏性哮喘炎癥應答的主要細胞[2-3]。IL-5，IL-4促進骨髓中嗜酸性粒細胞增殖以及隨后向肺臟的遷移， IL-4和IL-13參與抗體向IgE型轉(zhuǎn)換[4]。大量研究認為哮喘的病理生理過程與氣道中Th1/Th2免疫應答失調(diào)有關[5-6]。Th17以分泌IL-17為特征，哮喘患者中可見Th17細胞及IL-17細胞因子表達增多[7]。

2 動物選擇

為了研究人類過敏性哮喘，研究者建立了多種過敏性哮喘動物模型，目前沒有一種動物模型可以完全復制人類過敏性哮喘的病理過程，但是，這些動物模型對于我們了解過敏性哮喘的發(fā)病機制以及研究新的治療方法是有重要作用。

截至2018-12-16以(mouse[Title/Abstract]) OR murine[Title/Abstract]) OR mice[Title/Abstract]) AND allergic asthma[Title]為條件在PubMed中共檢出文獻640篇，以rat[Title/Abstract]) AND allergic asthma[Title]為條件檢索出文獻31篇，(guinea pig[Title/Abstract]) AND allergic asthma[Title]檢索出26篇，可見小鼠是目前最常用來誘導過敏性哮喘模型的動物種類，考慮與小鼠繁殖周期短，研究成本低，試驗技術成熟有關。大鼠及豚鼠過敏性哮喘模型各有特點，如挪威大鼠在變應原刺激后可以出現(xiàn)遲發(fā)性過敏反應，這一點在過敏性疾病的研究中很有意義[8]。猴子[9]哮喘模型和嚙齒類比起來更接近人類。綿羊[10]過敏性哮喘模型的出現(xiàn)為研究孕期過敏性哮喘對子代發(fā)育的影響提供了新的思路。各種基因修飾小鼠的研究為大家呈現(xiàn)出小鼠肺臟各種各樣的病理狀態(tài)，為哮喘發(fā)病機制以及變應原特異性免疫治療機制的研究提供了良好載體[11]。雖然哮喘的很多重要特征都可以在動物模型中體現(xiàn)出來，但動物模型不能體現(xiàn)人類哮喘全部特征。當然也有很少一部分自發(fā)氣道過敏模型比如貓[12]自發(fā)過敏所致的AHR模型和馬[13]慢性肺氣腫模型。

3 技術路線

過敏性哮喘小鼠模型建立的技術路線如下：第一步：致敏。異種蛋白致敏(大多是卵清蛋白)，這一步主要是通過腹腔注射含有佐劑的蛋白實現(xiàn)的，佐劑主要是氫氧化鋁，它能增加蛋白的免疫原性。致敏過程是讓免疫系統(tǒng)獲得對異種抗原反應的能力。第二步：激發(fā)。致敏后采用霧化吸入或滴鼻的方式使動物再次暴露于變應原，誘導肺臟產(chǎn)生炎癥反應以嗜酸性粒細胞浸潤，上皮細胞增厚和氣道高反應性為特征。經(jīng)典的誘導方法是腹腔內(nèi)注射卵清蛋白(ovalbumin，OVA)2次，之間間隔1～2周，后一次致敏后1周，每天用1% OVA對小鼠進行霧化，每天30 min，連續(xù)3 d[2]。過敏性炎癥一般會在激發(fā)后1～2 d達到高峰。有實驗用吸入一氧化氮代替腹腔注射氫氧化鋁佐劑來增強免疫應答[3]，提示在工業(yè)化國家大氣污染可能是哮喘發(fā)生的一個重要原因。而大氣污染另一項指標PM2.5作為佐劑參與哮喘的發(fā)病這一論點在對過敏性哮喘豚鼠的研究中得到證實[14]?，F(xiàn)在人們用塵螨、花粉、霉菌等誘導出的哮喘模型與人類的自然病程更加接近。過敏性哮喘患者接觸過敏原便可反復誘發(fā)癥狀發(fā)作，但反復吸入OVA的小鼠可對OVA產(chǎn)生免疫耐受，這種免疫耐受以炎癥和氣道高反應性的減弱為特征[5]。在沒有佐劑的情況下同時暴露于多種變應原也可以誘導出炎癥反應，并且能打破免疫耐受的屏障，誘導出慢性哮喘表型[15]。過敏性哮喘小鼠模型的研究依然是一個需要深入研究的領域，只有通過不斷摸索并改善試驗條件，才有可能誘發(fā)出更接近人類哮喘表型的動物模型。

4 肺功能測定方法

小鼠肺功能的測定方法主要有兩種。一種是非限制性體積描記法，評估指標為Penh(enhanced pause)。這種方法以獨立的非侵入性的方式測定肺容量來評估氣道阻力[16]。該種檢測方法操作簡單，因此得到廣泛應用，但Penh本質(zhì)上是反映肺臟呼吸形式的變化，容易受動物呼吸形式瞬間變異的影響。傳統(tǒng)有創(chuàng)的小鼠肺功能檢測方法是目前最可靠且沒有爭議的方法。這種檢測方法是在麻醉狀態(tài)下行氣管插管并規(guī)律機械通氣情況下測定小鼠氣道壓峰值，氣道壓峰值的增高提示肺臟擴張的阻力升高。這種情況下小鼠的呼吸完全受實驗者主觀掌握，避免了呼吸形式對肺功能測定的干擾。

5 過敏性哮喘模型中白介素家族細胞因子表達變化

過敏性哮喘是Th1/Th2應答失衡導致，細胞因子在免疫應答類型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)根據(jù)最新的動物模型研究進展，對參與過敏性哮喘生理過程的主要細胞因子做一總結(jié)。

5.1 IL-1

IL-1主要由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生。局部低濃度的IL-1可以增強抗原提呈細胞(Antigen presenting Cells,APC)的抗原提呈能力，協(xié)同抗原刺激CD4+T細胞活化，促進B細胞增殖和分泌抗體。IL-33是IL-1家族的一員，可以誘導Th2細胞因子的分泌。表達IL-33R的2型肺部先天性淋巴細胞(type 2 innate lymphoid cell，ILC2)存在于肺臟和縱膈淋巴結(jié)中，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中沒有。經(jīng)鼻滴入IL-33可以誘導出哮喘表型，肺部、縱膈淋巴結(jié)和BALF中出現(xiàn)ILC2s聚集[17]。對OVA過敏性哮喘小鼠腹腔注射抗IL-33抗體可以明顯降低血清中IgE的水平，減少嗜酸性粒細胞浸潤、黏液的分泌和淋巴細胞的數(shù)量，提示抗IL-33治療可能是過敏性哮喘一種新的治療方法[18-19]。

5.2 IL-4

IL-4的生物作用包括刺激和活化B細胞,刺激T細胞增殖及促進IgG向IgE類型轉(zhuǎn)化,從而引發(fā)哮喘，是 Th2 型最具代表性的細胞因子。Van Oosterhout等[20]發(fā)現(xiàn)，OVA過敏性哮喘小鼠接受免疫治療后血清IL-4水平減少。對過敏性哮喘患者分離出來的T,B細胞進行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，抗IL-4抗體(Anti-IL-4 antibody, Anti-IL-4 Ab)能強烈抑制淋巴細胞分泌IgE[21]。目前主流研究認為，IL-4是目前最合適的哮喘治療靶點之一[22]。Grunewald等[23]很早提到IL-4Ra拮抗劑可以阻止過敏性哮喘氣道炎癥的發(fā)展。

5.3 IL-5

IL-5主要由活化的CD4+T細胞和肥大細胞產(chǎn)生。IL-5可誘導過敏患者體內(nèi)嗜酸性粒細胞增多，還能促進嗜堿性粒細胞釋放組胺和白三烯等炎癥介質(zhì)。過敏性哮喘患者中IL-5的表達增高介導炎癥反應已經(jīng)得到認可，其表達水平可以作為過敏性哮喘炎癥程度一個參考指標。近年來抗IL-5對重癥哮喘的治療得到了足夠重視。塵螨誘導的小鼠哮喘模型發(fā)現(xiàn)，抗IL-5治療可以避免病毒導致的哮喘惡化，并使小鼠肺臟嗜酸性粒細胞浸潤明顯減輕[24]?！癕epolizumab和“Reslizumab”兩種拮抗IL-5活性的生物制劑已開始用于臨床，且取得明顯療效，但國內(nèi)尚未引進。“Mepolizumab和“Reslizumab”通過阻斷IL-5-Rα結(jié)合位點發(fā)揮抗IL-5活性的作用，既往也有人認為IL-5R的β亞基是IL-5發(fā)揮生理作用的關鍵，以β亞基為靶點的抗轉(zhuǎn)錄治療是一種潛在的過敏性哮喘新的治療方法[25]。

5.4 IL-9

IL-9主要是由Th細胞產(chǎn)生。IL-9可維持Th細胞生長，促進IL-4介導B細胞分化及IgE的表達，促進活化T細胞和肥大細胞增殖從而參與過敏反應。過表達IL-9轉(zhuǎn)基因鼠的出現(xiàn)提示IL-9可參與哮喘發(fā)展中嗜酸性粒細胞炎癥反應，AHR，IgE水平升高以及黏液分泌等過程[26]。

5.5 IL-10

IL-10主要由單核-巨噬細胞、調(diào)節(jié)性T細胞和調(diào)節(jié)性B細胞產(chǎn)生。小鼠哮喘模型中，IL-10在對變應原的Th2型免疫應答炎癥反應下游發(fā)揮重要作用，比如抑制肺臟嗜酸性粒細胞浸潤以及Th2型細胞因子的產(chǎn)生[27]。劉春濤等[28]研究提示IL-10可以下調(diào)哮喘小鼠氣道炎癥。臨床研究發(fā)現(xiàn)IL-10與哮喘的嚴重程度相關，與FEV1, FEV1%預計值和FEV1/FVC呈明顯正相關關系[29]，與動物研究基本一致?？梢奍L-10在哮喘的治療中起到明確的積極作用，可以作為評估哮喘嚴重程度以及治療效果潛在的指標。

5.6 IL-12

IL-12是經(jīng)典的Th1細胞因子，主要由B細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，可促進Th0細胞細胞向Th1細胞分化，為動物試驗中Th1型細胞免疫應答水平的標志因子之一。IL-12的缺失可以使免疫應答向Th2類型轉(zhuǎn)換。IL-35是IL-12家族的一員，越來越多哮喘動物模型的研究認為IL-35可以抑制氣道炎癥反應及AHR。缺少IL-35亞基的小鼠在接受OVA致敏并激發(fā)后表現(xiàn)出更高的氣道炎癥反應以及持續(xù)的AHR[30]。在OVA過敏性哮喘小鼠模型中，應用IL-35進行治療可以抑制AHR和氣道炎癥反應[31]。在塵螨誘導的過敏性哮喘模型中，通過滴鼻途徑給予小鼠IL-35DNA治療后氣道炎癥明顯減低，而肌肉注射IL-35可以抑制循環(huán)中sIgE以及tIgE的水平[32]。總之，IL-35可能是一種有效的可用于治療過敏性哮喘的細胞因子。

5.7 IL-13

IL-13是經(jīng)典的Th2細胞因子，IL-13是哮喘發(fā)生、發(fā)展過程中的一項重要的細胞因子[33]，與疾病嚴重程度明顯相關[34]。IL-13的過表達可以誘發(fā)出完整的小鼠過敏性哮喘模型[35-36]。IL-13還可以誘導小鼠氣道杯狀細胞增生和黏液分泌[37-38]。對塵螨和OVA過敏性哮喘小鼠中，2型肺部先天性淋巴細胞(ILC2s)同Th2細胞是過敏性哮喘小鼠體內(nèi)分泌IL-13的主要細胞[39]。Chen等[40]研究發(fā)現(xiàn)肺上皮細胞膜型 IL-13Rα2過表達可以使可溶性IL-13Rα2表達缺失的轉(zhuǎn)基因鼠AHR和肺部炎癥加重到與野生鼠相似的狀態(tài)，提示膜型 IL-13Rα2對肺部過敏性炎癥反應發(fā)揮重要作用。

5.8 IL-16

IL-16由活化的T細胞和B細胞、單核-巨噬細胞等合成。IL-6能夠促進T細胞表面IL-2R的表達，促進B細胞增殖、分化并產(chǎn)生抗體。上個世紀末Hessel等[41]對OVA過敏性哮喘小鼠研究發(fā)現(xiàn)，BALF離心后上清液能夠引起淋巴細胞明顯的遷移，加入抗IL-16抗體后，誘導淋巴細胞遷移的作用消失。 OVA激發(fā)階段給予抗IL-16抗體能明顯抑制OVA特異性IgE的表達?？笽L-16抗體還能抑制反復OVA激發(fā)引起的AHR，但是對嗜酸性粒細胞的浸潤沒有影響。

5.9 IL-17

IL-17A通過增強IL-13介導的免疫應答參與過敏性哮喘小鼠嚴重的氣道痙攣過程[42-43]，其表達水平與重癥哮喘是否發(fā)病明確相關。IL-17E即IL-25主要由天然的上皮細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞產(chǎn)生，可以導致嗜酸性粒細胞炎癥反應持續(xù)存在?？笽L-25抗體能夠明顯減輕小鼠過敏性哮喘模型的氣道炎癥反應[43-45]。致敏階段給予抗IL-25單克隆抗體(anti-IL-25 mAb)可以明顯降低血清Th2細胞因子IL-5和IL-13以及血清IgE的分泌，減輕嗜酸性粒細胞的浸潤和杯狀細胞的增生，防止氣道高反應性(airway hyperresponsiveness, AHR)的發(fā)生[46]。

6 小結(jié)

過敏性哮喘是一種變應原誘導的可逆性氣道阻塞為主的氣道炎癥性疾病，以氣道高反應性和黏膜下淋巴細胞以及嗜酸性粒細胞浸潤為主要特征。一個理想的過敏性哮喘動物模型應具備重復性好，其病變發(fā)展過程應盡可能與人類支氣管哮喘病因、病變過程相似等特點。根據(jù)不同研究目的建立的支氣管哮喘的動物模型種類繁多，現(xiàn)今用的最多的是Balb/c小鼠過敏性哮喘模型。小鼠過敏性哮喘模型具有技術路線成熟，實驗周期短，操作過程好掌握等優(yōu)點，但小鼠在停止吸入變應原激發(fā)后哮喘癥狀會消失。迄今為止沒有一種實驗模型能完全等同人類支氣管哮喘的病理生理過程。現(xiàn)有的模型大都僅能重現(xiàn)支氣管哮喘某些階段的形態(tài)及病理生理改變，但這些實驗模型的建立對闡明支氣管哮喘的發(fā)生及發(fā)展仍具有重要作用。隨著人類支氣管哮喘病因、發(fā)病機制研究的不斷完善，相信會探索出一種更適合支氣管哮喘研究的實驗模型。過敏性哮喘小鼠模型的研究依然是一個需要深入研究的領域，動物模型的研究還有很長的路要走。