胡朝軍，鄧垂文，李 萍，周仁芳，曾小峰

抗中性粒細胞胞漿抗體(Antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)是血管炎診斷的重要血清標(biāo)志物，在肉芽腫性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis, GPA)，顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis, MPA)和嗜酸性肉芽腫性多血管炎(eosinophilicgranulomatosis with polyangiitis, EGPA)的診斷中非常重要。除此之外，ANCA在肺部疾病[1]、腎臟疾病[2]、藥物誘導(dǎo)性血管炎[3]以及感染性疾病[4]中也存在較高的陽性率。ANCA檢測不僅有助于血管炎患者的診斷，其滴度水平的變化在一定程度上也可以反映其治療效果。采用乙醇和甲醛固定的人中性粒細胞作為基質(zhì)的間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)是臨床檢測ANCA最常用的方法。隨著ANCA靶抗原的鑒定，基于ANCA特異性靶抗原檢測的ELISA、化學(xué)發(fā)光[5]和多元微球檢測技術(shù)[6]逐漸應(yīng)用于ANCA的臨床檢測。根據(jù)目前ANCA檢測國際共識，結(jié)合IIF檢測ANCA(IIF-ANCA)和針對蛋白酶3(PR3)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)靶抗原特異性抗體檢測方法的組合檢測方案能發(fā)揮ANCA在臨床應(yīng)用中的最佳價值[7]。IIF-ANCA在臨床工作中非常重要，但其結(jié)果判讀具有較高的專業(yè)難度，在我國醫(yī)院臨床實驗室的檢測普及程度并不理想。本研究依托中國醫(yī)師協(xié)會風(fēng)濕免疫科醫(yī)師分會自身抗體檢測專業(yè)委員會發(fā)起的IIF-ANCA熒光判讀培訓(xùn)項目，對在規(guī)定時間內(nèi)參加網(wǎng)絡(luò)注冊的用戶進行IIF-ANCA檢測現(xiàn)狀調(diào)查。

1 對象與方法

1.1 參與對象

風(fēng)濕免疫性疾病診療領(lǐng)域臨床實驗工作中從事IIF-ANCA常規(guī)檢測的人員。

1.2 參與方式

中國醫(yī)師協(xié)會風(fēng)濕免疫科醫(yī)師分會自身抗體檢測專業(yè)委員通過網(wǎng)絡(luò)形式向風(fēng)濕免疫性疾病診療領(lǐng)域的實驗室從業(yè)人員發(fā)放參與通知。自愿參與IIF-ANCA熒光判讀培訓(xùn)的相關(guān)人員于2017年9月28日至10月31日間通過IIF-ANCA熒光判讀培訓(xùn)認證項目網(wǎng)址(http://afotc.criponline.com/)自愿注冊并填寫相關(guān)信息。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

多個組均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA分析，兩組間均數(shù)的比較采用獨立樣本T檢驗。多個組構(gòu)成比的比較采用R*C表χ2檢驗，兩個組構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 參與IIF-ANCA檢測注冊調(diào)查實驗室人員地域分布

在規(guī)定時間內(nèi)完成注冊并填寫相關(guān)信息的IIF-ANCA實驗室檢測人員共計800人，來自于中國大陸的22個省、4個直轄市及5個自治區(qū)，311家醫(yī)療單位、4家第三方檢測公司的下屬20家第三方實驗室，共計334家實驗室。各省市自治區(qū)參與注冊調(diào)查的IIF-ANCA檢測人員中參加人數(shù)≥100人僅河南省，參加人數(shù)在100～50之間的省份共計6個，參加人數(shù)50～10之間的省份共計11個，參加人數(shù)≤10的省份共計13個(表1)。

2.2 IIF-ANCA檢測實驗室分布

參與本次調(diào)查從事IIF-ANCA檢測人員來自334家實驗室，包括262家醫(yī)院檢驗科的實驗室(占78.44%)、39家?？茖嶒炇?占11.68%)、13家醫(yī)院中心實驗室(占3.89%)及4家第三方檢測公司下屬的20家第三方實驗室(占5.99%)。

2.3 開展IIF-ANCA檢測實驗室IIF-ANCA檢測量

參與本次調(diào)查開展IIF-ANCA檢測的實驗室每周IIF-ANCA檢測總量：醫(yī)院檢驗科實驗室IIF-ANCA檢測總量為15 138人次/周，占68.39%；第三方實驗室IIF-ANCA檢測總量為3 788人次/周，占17.11%；醫(yī)院?？茖嶒炇襂IF-ANCA檢測總量為2 821人次/周，占12.75%；醫(yī)院的中心實驗室IIF-ANCA檢測總量為387人次/周，占1.75%。第三方實驗室、?？茖嶒炇?、檢驗科實驗室和中心實驗室平均每周檢測量依次減小，其中檢驗科和中心實驗室平均每周檢測量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)(圖1)。

2.4 從事IIF-ANCA檢測實驗室人員數(shù)量

參與本次調(diào)查開展IIF-ANCA檢測各類實驗室從事IIF-ANCA檢測人員1 561人，其中醫(yī)院檢驗科實驗室人員為1 250人，占80.08%；第三方實驗室人員為89人，占5.70%；醫(yī)院?？茖嶒炇胰藛T為175人，占11.21%；中心實驗室47人，占3.01%。

表1 參與IIF-ANCA檢測注冊調(diào)查人員的地域分布Table 1 Geographical distribution of registered investigators participating in IIF-ANCA testing

圖 1 各實驗室IIF-ANCA每周平均檢測量Fig 1 Average weekly detection of each laboratory

各類實驗室從事IIF-ANCA檢測的人員平均數(shù)量間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 從事IIF-ANCA檢測實驗室人員學(xué)歷及專業(yè)技術(shù)職稱

工作中IIF-ANCA實驗室專職人員(在實驗室主要從事自身抗體檢測工作)和非專職人員(在實驗室主要工作并非從事自身抗體檢測)的學(xué)歷構(gòu)成差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，IIF-ANCA檢測實驗室專職人員和非專職人員技術(shù)職稱構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

2.6 IIF-ANCA檢測采用的滴度系統(tǒng)

參與本次調(diào)查的IIF-ANCA檢測實驗室主要采用10的開方系統(tǒng)(即1∶10,1∶32,1∶100,1∶320,1∶1 000……稀釋系統(tǒng))與倍比稀釋系統(tǒng)(即1∶10,1∶20,1∶40,1∶80,1∶160,1∶320……稀釋系統(tǒng))，比例為1∶1.4。第三方實驗室全部采用10的開方系統(tǒng)，?？茖嶒炇也捎帽侗认♂屜到y(tǒng)與10的開方系統(tǒng)的比例為1.2∶1;各實驗室采用10的開方系統(tǒng)和倍比稀釋系統(tǒng)的構(gòu)成比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.005)(圖3)。

3 討論

ANCA檢測主要用于ANCA相關(guān)性血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)的診斷及病情活動性監(jiān)測。1999年和2003年的ANCA國際指南共識均認為，ANCA滴度與AAV疾病活動度密切相關(guān)，經(jīng)過激素和免疫抑制劑治療后，滴度通常會逐漸降低，臨床癥狀也隨之好轉(zhuǎn)，復(fù)發(fā)的AAV患者中約有50%伴有ANCA滴度升高[7-8]。ANCA檢測的基本要求為所有懷疑為AAV的患者都應(yīng)采用IIF法篩查，陽性患者進一步確認PR3-ANCA和MPO-ANCA。如果條件允許，ANCA檢測應(yīng)采用IIF法篩查ANCA聯(lián)合其他方法檢測PR3-ANCA和MPO-ANCA。目前，ANCA的篩查仍然首選IIF法，但值得注意的是，我國小血管炎患者以MPA為主，此類患者體內(nèi)最常見的核周型ANCA(perinuclear ANCA, pANCA)對AAV的特異性并不高，還可見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎等患者。如果聯(lián)合采用IIF-ANCA與PR3-ANCA、MPO-ANCA，可提高ANCA在診斷AAV中的特異性。胞漿型ANCA(cytoplasmic ANCA, cANCA)合并PR3-ANCA陽性，核周型ANCA(pANCA)合并MPO-ANCA陽性，對于診斷AAV的特異性可達99%。根據(jù)國際上關(guān)于ANCA檢測和報告的共識聲明，ANCA用于AAV臨床診斷和病情活動時，采用乙醇固定的人中性粒細胞IIF聯(lián)合PR3-ANCA、MPO-ANCA是最佳的選擇。

圖2開展IIF-ANCA檢測實驗室人員學(xué)歷及專業(yè)技術(shù)職稱分布圖

Fig2Distribution of qualification and professional titles of personnel in laboratory conducting IIF-ANCA testing

圖3IIF-ANCA檢測采用的滴度系統(tǒng)分布

Fig3Distribution of titer systems used in IIF-ANCA testing

另外，ANCA也可見于潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)[9]，在上述疾病中的ANCA的陽性率可高達60%～80%。但其靶抗原主要為殺菌/通透性增強蛋白(bactericidal permeability-increasing protein，BPI)、乳鐵蛋白(lactotransferrin，LF)、組織蛋白酶G(cathepsin G，cath G)、人中性粒細胞彈力蛋白酶(human neutrophil elastase，HNE)、溶菌酶(lysozyme)，而并非常見的MPO和PR3[10]。因此，在這類患者中采用IIF檢測ANCA,比PR3-ANCA、MPO-ANCA檢測具有更高的敏感性。

本次問卷調(diào)查數(shù)據(jù)反映我國能開展IIF-ANCA檢測的實驗室覆蓋中國大陸各省、直轄市和自治區(qū)，檢測的實驗室主要分布在醫(yī)院檢驗科和臨床?？茖嶒炇遥獻IF-ANCA檢測總量最多的是醫(yī)院檢驗科和第三方實驗室，而平均每周檢測量以第三方實驗室最多。由于檢測ANCA的標(biāo)本量較少，而且采用IIF進行ANCA檢測因涉及顯微鏡下熒光形態(tài)學(xué)識別，技術(shù)含量較高，很多實驗室較難開展該項目，本次問卷調(diào)查數(shù)據(jù)可見第三方實驗室在IIF-ANCA項目集中檢測的優(yōu)勢更加明顯。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，從事IIF-ANCA檢測人員1 561人，其中80.08%在醫(yī)院檢驗科，11.21%在專科實驗室。但是檢驗科、?？茖嶒炇液偷谌綄嶒炇颐總€實驗室從事IIF-ANCA檢測的平均人數(shù)基本一致(4.5～4.8人)。由于自身抗體檢測特別是IIF-ANCA檢測不同于實驗室的常規(guī)生化或免疫項目檢測，其專業(yè)性較強。在參與問卷調(diào)查的人員中，專職從事IIF-ANCA檢測人員占67.4%(539/800)。學(xué)歷以本科為主占56.4%(451/800)，專業(yè)技術(shù)職稱以中級為主，占55.3%(443/800)，該特點也體現(xiàn)出IIF-ANCA檢測專業(yè)性較強的特征。

參與本次調(diào)查的我國開展IIF-ANCA檢測的全部實驗室中，采用倍比稀釋系統(tǒng)與10的開方系統(tǒng)的比例為1∶1.4。但是第三方實驗室，全部采用10的開方系統(tǒng)，?？茖嶒炇也捎帽侗认♂屜到y(tǒng)與10的開方系統(tǒng)的比例為1.2∶1。由此可見?？茖嶒炇覚z測IIF-ANCA更傾向于采用臨床醫(yī)生診療習(xí)慣的抗體倍比稀釋系統(tǒng)，而第三方實驗室檢測IIF-ANCA更傾向于嚴格按照試劑操作說明進行。

綜上，本次IIF-ANCA檢測問卷調(diào)查結(jié)果表明，IIF-ANCA檢測覆蓋中國大陸各省、直轄市和自治區(qū)，檢測人員以本科學(xué)歷和中級技術(shù)職稱為主。我國ANCA檢測標(biāo)準(zhǔn)化較差，與國外報道的情況[11]基本一致，采用的滴度系統(tǒng)有待逐步規(guī)范統(tǒng)一，以便進一步發(fā)揮IIF-ANCA檢測的臨床應(yīng)用價值。