魚清雅，郭從嘉，畢 進，張思程，符亮明，侯 杰，陳麗珍

海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（海口571199）

冰糖草是玄參科植物野甘草Scoparia dulcis L.的全草，為多年生草本植物，資源豐富，主要分布于海南、廣西、廣東、福建、臺灣等地，其性涼，味甘，是一味常用民族藥；具有清熱解毒，疏風(fēng)止咳，利尿消腫之效，用于肺熱咳嗽、腳氣浮腫、濕熱黃疸、皮膚濕疹、暑熱吐瀉、高血壓和丹毒等病證［1－2］。國內(nèi)外有少量文獻對冰糖草全草的化學(xué)成分、藥理活性、生藥學(xué)等方面進行了研究，表明黃酮類化合物為其主要有效成分之一，是一種極具開發(fā)應(yīng)用前景的中草藥［3－5］。在海南島，黎族民間常用冰糖草的莖和葉治療咽喉炎、跌打損傷等癥；目前關(guān)于海南黎藥冰糖草的研究報道比較少，研究內(nèi)容主要是其質(zhì)量控制方面［6］?？傸S酮成分廣泛存在于植物體內(nèi)，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基、鎮(zhèn)痛抗炎、保肝和保護心血管系統(tǒng)等多種生理活性［7－8］；且絕大多數(shù)以苷的形式存在，少數(shù)以游離的苷元形式存在。因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)不同其溶解度有很大差異，提取方法也不盡相同，其中超聲波提取以其選擇性高、快速高效、有效成分提取率較高、適于熱不穩(wěn)定物質(zhì)等優(yōu)點為眾多科研工作者所采用［9－12］。由于乙醇毒性較小，安全性高，對天然植物細胞的穿透能力較強，且乙醇提取液不易發(fā)霉變質(zhì)，故本實驗選擇乙醇作為提取溶劑。本實驗采用正交試驗法對海南黎藥冰糖草莖葉中總黃酮的提取工藝進行研究，為海南黎藥冰糖草莖葉中有效成分的提取提供參考。

材料與方法

1 材料

1.1 原料與試劑：冰糖草采自海南省萬寧市龍滾鎮(zhèn)，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院曾念開教授鑒定為玄參科植物野甘草Scoparia dulcis L.的全草，分取莖葉部分，烘干，粉粹并過80目篩，密封低溫干燥避光保存?zhèn)溆?。蘆丁標準品（上海源葉生物科技有限公司，編號B20771），硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇為分析純；水為雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備：DFY－1000D型封閉式粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司），DHG－9075A電熱干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），SK3210HP超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），SHZ－D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司），RE－2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），AE100電子分析天平（上海梅特勒－賽托利多儀器有限公司），UV－1600型紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）。

2 試驗方法

2.1 蘆丁標準曲線的建立［4－5］：精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品12.30mg，用70%乙醇溶解，并定容至50ml容量瓶，搖勻，即得蘆丁標準溶液。精確吸取0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml的蘆丁標準溶液分別置于25ml容量瓶中，各依次加入5%亞硝酸鈉溶液1.0ml，混勻靜置6min；加入10%硝酸鋁溶液1.0ml，混勻靜置6min；最后加入4%氫氧化鈉溶液4.0ml，加雙蒸水定容，混勻靜置15min，以溶劑空白為參比，于510nm處測定吸光度A。以蘆丁濃度C為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：A＝10.677C－0.0028，R2＝0.9996。表明蘆丁在4.9～78.7μg／ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 樣品的提取與測定：準確稱取黎藥冰糖草莖葉粉末約4.0g于磨口三角瓶中，在設(shè)定的試驗條件下按一定的乙醇濃度、液料比、超聲溫度、超聲時間和超聲功率進行超聲波提取，固定提取次數(shù)為2次，抽濾，合并2次濾液，定容于容量瓶中，搖勻即得待測樣品溶液。精確量取一定量樣品溶液，按照標準曲線的方法測定吸光度，并計算得黎藥冰糖草莖葉中總黃酮得率。

2.3 單因素試驗：在其他條件：乙醇濃度70%、液料比20∶1ml／g、超聲時間40min、超聲溫度50℃、超聲功率250W相同的情況下，分別考察超聲溫度（35、40、45、50、55、60℃）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1ml／g）、超聲功率（125、150、175、200、225、250W）、乙醇濃度（40、50、60、70、80、90%）、超聲時間（20、40、60、80、100、120min）對海南黎藥冰糖草莖葉中總黃酮得率的影響。

2.4 正交試驗及驗證：為了系統(tǒng)考察海南黎藥冰糖草莖葉中總黃酮的超聲波輔助乙醇提取法的工藝參數(shù)，在單因素試驗各因素對提取得率影響的大小、各因素的變化范圍和各因素的最佳值的基礎(chǔ)上，以總黃酮得率為考察指標，設(shè)計了L16（45）正交試驗對黎藥冰糖草莖葉中總黃酮提取方法的工藝條件進行優(yōu)化，并確定與驗證最佳提取工藝條件。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

結(jié) 果

1 單因素試驗

1.1 液料比的影響：液料比對黎藥冰糖草莖葉中總黃酮得率的影響結(jié)果見圖1。隨著液料比的增加，總黃酮得率也逐漸升高；當液料比達到30∶1ml／g后，繼續(xù)增加液料比，提取得率開始下降。這是由于在總黃酮提取過程中，增加液料比能夠增大原料與提取液的接觸面積，也能增大溶液的滲透壓，有利于總黃酮的滲出，因此乙醇濃度較低時，底物濃度較高，二者不能充分反應(yīng)，冰糖草莖葉中的大部分總黃酮無法擴散到溶液中；隨著乙醇濃度增加，總黃酮提取得率則明顯增加。而液料比過大會影響多糖和蛋白的擴散速率和溶出平衡，最終干擾總黃酮的提取。故應(yīng)選擇左右為宜。故選擇液料比為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1ml／g作為正交試驗的四個水平較為合適。

圖1 液料比對黃酮得率的影響

1.2 超聲溫度的影響：超聲溫度對黎藥冰糖草莖葉中總黃酮得率的影響結(jié)果見圖2。隨著超聲溫度的升高，總黃酮得率逐漸增加，當溫度大于55℃以后提取得率開始稍微下降。這是由于隨著溫度的升高，物質(zhì)擴散速度加，分子運動加劇，有利于黃酮的提取。但是溫度過高，影響黃酮結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，一些熱敏性的黃酮逐漸分解，繼而導(dǎo)致得率下降。故選擇超聲提取溫度為45、50、55、60℃為正交試驗的四個水平較為合適。

圖2 超聲溫度對黃酮得率的影響

1.3 超聲時間的影響：超聲提取時間對黎藥冰糖草莖葉中總黃酮得率的影響結(jié)果見圖3。在20～80 min的超聲時間內(nèi)，隨著時間的增大提取得率隨之增加，但超過80min后提取量增加較小并呈大幅度下降趨勢。這可能是由于冰糖草莖葉中其他成分的溶出，干擾總黃酮的提取。故選擇超聲提取時間為20、40、60、80min為正交試驗的四個水平較為合適。

1.4 乙醇濃度的影響：乙醇濃度對黎藥冰糖草莖葉中總黃酮得率的影響結(jié)果見圖4。在40～70%的乙醇濃度時，隨著乙醇濃度的增加提取得率有較顯著的增加，且在乙醇濃度為70%時達到最高；隨后繼續(xù)增大時則呈下降趨勢。這是由于適當提高乙醇濃度可以加速黃酮的溶出，而乙醇濃度過高會導(dǎo)致溶劑的極性下降，進而使一些黃酮苷的溶解度下降，干擾黃酮的提取。故選擇乙醇濃度為60、70、80、90%作為正交試驗的四個水平較為合適。

1.5 超聲功率的影響：超聲功率對黎藥冰糖草莖葉中總黃酮得率的影響結(jié)果見圖5。隨著超聲功率的升高，總黃酮提取得率呈先增加后減少的趨勢，當超聲功率為175W時，得率最高；繼續(xù)升高超聲功率，得率開始下降。因此，超聲功率選擇175、200、225、250W為正交試驗的四個水平較為合適。

圖3 超聲時間對黃酮得率的影響

圖4 乙醇濃度對黃酮得率的影響

圖5 超聲功率對黃酮得率的影響

2 正交試驗結(jié)果與驗證

2.1 正交試驗結(jié)果：正交試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表2。

由表2可知，不同因素水平對海南黎藥冰糖草莖葉中總黃酮提取得率有不同影響，從極差R值可知，5個因素對總黃酮得率的影響大小依次為D＞A＞B＞C＞E，即乙醇濃度對總黃酮得率的影響最大，其次是液料比、超聲溫度和超聲時間，超聲功率的影響相對較小。正交試驗中，黎藥冰糖草莖葉中黃酮得率最高的是第10組，高達25.33mg／g，從各因素的不同水平看，A因素和D因素第3個水平最好，B因素第2個水平最好，C因素和E因素第4個水平最好，所以最優(yōu)工藝組合為A3B2C4D3E4，即液料比30∶1ml／g、超聲溫度50℃、超聲時間80min、乙醇濃度80%、超聲功率250W。

通過直觀分析，E因素影響不顯著，故以E因素作為誤差進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，因素A（液料比）和因素D（乙醇濃度）具有顯著性；因素B（超聲溫度），因素C（超聲時間）、因素E（超聲功率）均不具有顯著性。說明在海南冰糖草莖葉中總黃酮的提取工藝中，乙醇濃度和液料比是影響總黃酮得率的主要因素，在工藝優(yōu)化中應(yīng)該重點考慮。

2.2 最佳提取工藝的驗證：在最佳工藝條件下做5次平行試驗，所得黎藥冰糖草莖葉中總黃酮得率分別為25.32、25.15、25.40、25.48、25.43mg／g，平均得率為25.36mg／g，比正交試驗中的任何一次試驗的得率都高，標準偏差為0.13%，相對標準偏差（RSD）為0.51%。由此表明正交試驗得到的最佳工藝條件結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，且比較穩(wěn)定。

表3 方差分析結(jié)果

表2 L16（45）正交試驗結(jié)果

討 論

本研究采用超聲波輔助乙醇提取海南黎藥冰糖草莖葉中總黃酮成分，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗設(shè)計對冰糖草莖葉中總黃酮成分的提取工藝進行了優(yōu)化，以期能為合理開發(fā)利用冰糖草奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示，海南黎藥冰糖草莖葉中總黃酮成分的最佳提取工藝為液料比30∶1ml／g、超聲溫度50℃、超聲時間80min、乙醇濃度80%、超聲功率250W，在此條件下經(jīng)驗證試驗所測得總黃酮得率為25.36mg／g，且該最佳工藝重現(xiàn)性好，較為穩(wěn)定。因此，正交試驗法優(yōu)化后確定的黎藥冰糖草莖葉中總黃酮成分的超聲波輔助提取工藝簡單可靠，提取得率較高，經(jīng)濟方便，具有快速、高效等優(yōu)點。為進一步研究開發(fā)利用海南黎藥冰糖草資源提供了實驗參考和理論依據(jù)。