孫曉偉，王新宇，孫忠人，劉 昊，王 博,張 菶，劉 丹，劉 勇，陳英華，金 弘，李洪濤△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310012)

腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)[1]指腦組織在血供中斷的情況下，經(jīng)溶栓等治療手段及時(shí)恢復(fù)再灌注后，其組織損傷和功能障礙反而加重，甚至導(dǎo)致不可逆性的損傷。一般根據(jù)損傷區(qū)殘存的血流量將其分為中心梗死區(qū)和半暗帶區(qū)，中心區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞死亡形式主要以細(xì)胞壞死為主，而半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞死亡多表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡和自噬性死亡。因半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞仍存在一定的代謝活力，故拮抗該區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡以及自噬性死亡是減輕腦缺血再灌注損傷的病理關(guān)鍵。而目前越來(lái)越多的研究表明[2-4]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激常常誘導(dǎo)CIRI后半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和自噬性死亡，是腦缺血再灌注引起神經(jīng)損傷的重要環(huán)節(jié)，因此，調(diào)控腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，有望成為防治CIRI的新策略。

中醫(yī)學(xué)的針刺療法治療缺血性腦卒中歷史悠久，現(xiàn)以其穩(wěn)定的療效、治療的整體性、治療靶點(diǎn)的多樣化以及毒副作用小和成本低等優(yōu)勢(shì)，得到了國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛認(rèn)可，其治療的作用機(jī)理也得到逐步的闡釋。有研究表明[5]，針刺對(duì)CIRI后誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞自噬均有良性的調(diào)節(jié)作用。本研究搜集國(guó)內(nèi)外近10年來(lái)關(guān)于針刺對(duì)CIRI誘導(dǎo)ERS的影響的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，以期為臨床應(yīng)用針刺防治缺血性卒中提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激概述

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是負(fù)責(zé)生物合成和信號(hào)傳遞的精密細(xì)胞器，對(duì)維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及決定細(xì)胞生存具有重要意義。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境的變化如缺血缺氧、毒素、能量供應(yīng)障礙等具有非常高的敏感特性，當(dāng)受到諸如此類的壓力刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞，功能失衡，蛋白質(zhì)折疊受阻，大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)蓄積其中，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)[6]，并進(jìn)一步激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)或未折疊蛋白反應(yīng)(Unfold protein response, UPR)。適度的UPR可通過(guò)增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性蛋白降解途徑(ERAD)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)堆積在網(wǎng)腔內(nèi)的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)的處理，以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)平衡，保障細(xì)胞存活。而持久劇烈的UPR會(huì)進(jìn)一步激活細(xì)胞的程序性死亡途徑，誘發(fā)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡。

2 腦缺血再灌注損傷誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

腦缺血再灌注期間組織內(nèi)無(wú)氧代謝增強(qiáng)，ATP釋放水平迅速降低，無(wú)法維持神經(jīng)元能量的供應(yīng)，導(dǎo)致ATP依賴的離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制失調(diào)，Ca2+不能正常的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)，加之內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子的進(jìn)一步釋放，引發(fā)Ca2+超載，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)通道及其功能，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)二硫鍵形成減少，蛋白質(zhì)折疊出現(xiàn)錯(cuò)誤，誘發(fā)ERS[7]。而過(guò)度的ERS又進(jìn)一步加重細(xì)胞內(nèi)鈣平衡的紊亂，二者在CIRI損傷的病理過(guò)程中互相促進(jìn)、互為因果。同時(shí)腦組織缺血再灌注后，白細(xì)胞在缺血組織中大量浸潤(rùn)，清除壞死組織細(xì)胞產(chǎn)生的大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，而ROS是誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的又一條件，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑引起細(xì)胞自噬與凋亡[8]。因此，通過(guò)抑制過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷、促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)，進(jìn)而減弱神經(jīng)細(xì)胞自噬和凋亡是減輕CIRI的重要機(jī)制之一。

3 針刺調(diào)控CIRI后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究概況

目前大量的實(shí)驗(yàn)研究表明[5-9]，針刺對(duì)大鼠腦缺血再灌注后誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)以及過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞自噬和神經(jīng)細(xì)胞凋亡均有一定的影響。

3.1 針刺對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的促細(xì)胞生存通路具有調(diào)節(jié)作用

UPR發(fā)揮調(diào)控作用涉及到諸多酶和轉(zhuǎn)錄因子，目前研究較多的有3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜受體[10]：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Protein kinase R-like ER kinase，PERK) 、抑制物阻抗性激酶1(Inositol requiring enzyme 1，IRE-1) 和活性轉(zhuǎn)錄因子6( Activating transcription factor 6，ATF6) 。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein78/Binding immuno-globulin protein，GRP78/Bip)是一種鈣離子結(jié)合分子伴侶，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，對(duì)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞正?；钚跃哂兄匾饔?。正常生理狀況下，GRP78與PERK、IRE-1、ATF6這三種跨膜受體緊密結(jié)合，處于無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，GRP78分別與之解離，轉(zhuǎn)而與未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。游離的PERK及IRE1通過(guò)自身磷酸化和二聚化被激活，ATF6經(jīng)蛋白酶S1P和S2P在高爾基體內(nèi)剪切后被激活，隨后分別激活各自的下游信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控。

目前，多數(shù)學(xué)者將GRP78蛋白的上調(diào)，作為ERS啟動(dòng)的標(biāo)志因子[11]。腦缺血時(shí)，由于缺血缺氧等壓力刺激導(dǎo)致ER內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，蛋白質(zhì)折疊受到干擾，出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊蛋白及未折疊蛋白的蓄積，隨即誘導(dǎo)GRP78表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而與異常折疊蛋白進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，減少了錯(cuò)誤折疊蛋白的數(shù)量，緩解了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力負(fù)荷，發(fā)揮了促細(xì)胞存活的作用[12]。較多研究顯示[13-14]，在ERS狀態(tài)下，針刺可通過(guò)上調(diào)GRP78蛋白的表達(dá)，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中異常折疊蛋白數(shù)量，從而發(fā)揮其神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。陳懷龍等[15]對(duì)腦缺血再灌注損傷的大鼠采用針刺大椎、百會(huì)穴預(yù)處理后，檢測(cè)到GRP78的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，通過(guò)光鏡下觀察到缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元異常形態(tài)數(shù)量的降低，提示上調(diào)GRP78的表達(dá)、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是電針預(yù)處理腦保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。J Shen等[16]同樣發(fā)現(xiàn)電針內(nèi)關(guān)、百會(huì)穴可以通過(guò)激活ERS、上調(diào)GRP78的表達(dá)，保護(hù)腦缺血再灌注損傷大鼠的缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞。

3.2 針刺對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抑制作用

在ERS中細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)與C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12( Caspase-12)及c-Jun 氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK) 信號(hào)通路有關(guān)[17]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)凋亡的標(biāo)志性基因[18]。PERK、ATF6以及IRE-1都能誘導(dǎo)CHOP的轉(zhuǎn)錄[19]。其中PERK-eIF2α-ATF4是CHOP蛋白表達(dá)主要途徑。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)劇烈存在時(shí)PERK進(jìn)一步被激活，促進(jìn)ATF4翻譯，誘導(dǎo)CHOP表達(dá)，破壞GRP78的保護(hù)作用而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。Caspase-12是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中促進(jìn)凋亡的第2條信號(hào)通路，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的固有蛋白，能夠單獨(dú)通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ERS未發(fā)生時(shí)，Caspase-12與Caspase-7和GRP78結(jié)合形成復(fù)合物，凋亡途徑未被激活；ERS發(fā)生時(shí)，GRP78表達(dá)降低，Caspase-12不能與其充分結(jié)合，則Caspase-12被激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中的Caspase-9被激活，通過(guò)Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將激活信號(hào)傳遞給Caspase-3，最終引起細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中活化的JNK信號(hào)通路在應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞死亡過(guò)程中扮演著重要角色，被認(rèn)為是除CHOP與Caspase-12之外的另一條促凋亡通路[20]。活化的IRE1和腫瘤壞死因子受體-相關(guān)因子2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2)結(jié)合，激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)酶1(Apoptosis signal-regulating kinase-1，ASK1)，最終激活JNK通路，活化Caspase-12引起細(xì)胞凋亡[21]。張亞敏[22]采用電針百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)電針可通過(guò)上調(diào)抑制凋亡基因Bcl-2的釋放，下調(diào)CHOP、Caspase12 mRNA及凋亡基因Bax的表達(dá)，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，為臨床針灸應(yīng)用于缺血性腦血管病治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。宋洋[23]對(duì)MCAO大鼠局灶性腦缺血模型電針百會(huì)、內(nèi)關(guān)穴治療后發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)功能障礙有所改善，行為學(xué)評(píng)分呈降低趨勢(shì)。結(jié)果證明針刺可通過(guò)下調(diào)大鼠腦缺血再灌注后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路PERK、eIF2α、ATF4基因表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，繼而減輕腦缺血再灌注損傷，其作用與依達(dá)拉奉相當(dāng)。李文慧[24]通過(guò)手術(shù)制造腦缺血再灌注損傷大鼠模型，發(fā)現(xiàn)手術(shù)造模組大鼠CHOPmRNA表達(dá)明顯升高，說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能出現(xiàn)異常。在百會(huì)、內(nèi)關(guān)穴進(jìn)行針刺干預(yù)后，CHOPmRNA表達(dá)顯著降低，最終表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著下降，腦梗死體積百分比有所減小。其他研究學(xué)者[25-27]發(fā)現(xiàn),針刺可有效抑制腦缺血神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)性GRP78表達(dá)及抑制促凋亡Caspase-12表達(dá)有關(guān)。

3.3 針刺對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬具有良性的調(diào)節(jié)作用

ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡除細(xì)胞凋亡之外，還包括另一種程序性細(xì)胞死亡方式，即自噬性細(xì)胞死亡(autophagic cell death, ACD)。在腦缺血損傷中，自噬具有雙面性[28]，自噬早期能有效清除細(xì)胞內(nèi)受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，消除UPR和降解蛋白聚集體，有助于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白的正確折疊，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡[29]。而過(guò)度的自噬可引起自噬性細(xì)胞死亡，加重神經(jīng)細(xì)胞損傷[30]。Beclin1和LC3在哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。Beclin1 主要通過(guò)與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶形成復(fù)合物參與自噬體的形成，其可介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于自噬泡，從而調(diào)控自噬體的形成與成熟[31]，是自噬啟動(dòng)的標(biāo)志[32]。ERS可通過(guò)PERK-eIF2α-ATF4通路激活自噬相關(guān)基因12(Atg12)，使微管相關(guān)蛋白輕鏈3-I(LC3-I)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-II，誘發(fā)細(xì)胞自噬[33]。其中LC3-Ⅱ被看作是監(jiān)測(cè)自噬活性的特異性標(biāo)志物[34]，因此細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的表達(dá)變化可作為檢測(cè)自噬狀態(tài)的參考因子，Beclin1和 LC3-Ⅱ的大量表達(dá)可促進(jìn)自噬發(fā)生[35]。有報(bào)道[36-38]認(rèn)為,自噬可能是針刺減輕神經(jīng)損傷、改善神經(jīng)功能的機(jī)制之一。徐勤紅等[39]采用“調(diào)神通督針?lè)ā敝委熂毙阅X梗死療效肯定，分析其作用機(jī)制可能是通過(guò)增加自噬量LC3-Ⅱ和Beclin1發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用。舒適[5]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，電針?biāo)疁涎▽?duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)具有明確療效，其機(jī)制從上調(diào)ERS促生存細(xì)胞途徑、減弱CHOP的表達(dá)以及抑制自噬表達(dá)水平共同發(fā)揮作用。馮曉東等[40]在腦缺血再灌注模型大鼠給予電針刺激后監(jiān)測(cè)到腦組織中的Beclin-1表達(dá)上調(diào)，提出電針可通過(guò)提高自噬系統(tǒng)的表達(dá)水平而促進(jìn)腦缺血再灌注損傷后大鼠的認(rèn)知功能的恢復(fù)。

4 小結(jié)

綜上所述，ERS在CIRI損傷的病理進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，一方面可激活UPR，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的處理，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞；另一方面又與CIRI后神經(jīng)細(xì)胞的自噬、凋亡等現(xiàn)象密切相關(guān)。因此，對(duì)CIRI后神經(jīng)細(xì)胞ERS及其調(diào)節(jié)機(jī)制展開(kāi)研究，具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。針刺對(duì)CIRI后ERS及其誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡的研究尚處于起步階段，許多研究?jī)H是針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的促生存蛋白分子和ERS導(dǎo)致凋亡或自噬的某單一通路展開(kāi)研究，且缺乏特異性的抑制劑、慢病毒干擾以及相關(guān)基因敲除等現(xiàn)代科技手段作對(duì)照，同時(shí)大多研究也忽略了假針刺及非穴位組的設(shè)立，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上尚缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性與科學(xué)性。但相信隨著現(xiàn)代科研技術(shù)手段的不斷進(jìn)步，隨著針刺調(diào)控CIRI后ERS、細(xì)胞自噬與凋亡的嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范和更加細(xì)微深入的研究，針刺對(duì)CIRI后ERS、自噬與凋亡的調(diào)控機(jī)制會(huì)更加科學(xué)化、明確化，從而為缺血性腦卒中及腦缺血再灌注損傷的防治取得突破性的進(jìn)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。