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(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波315211)

蔬菜的腌制是我國傳統(tǒng)的蔬菜加工方法，其加工簡易，成本低廉，產(chǎn)品易于保存。腌制蔬菜具有獨(dú)特的色、香、味，是人們餐桌上不可或缺的佐餐食品[1]。冬瓜是一年生攀緣性草本植物，葫蘆科冬瓜屬，其性甘平，具有清熱養(yǎng)胃，蕩滌腸內(nèi)穢物的功效，為夏秋季主要蔬菜之一；冬瓜中含有蛋白質(zhì)、糖、粗纖維、鈣、胡蘿卜素、核黃素、磷、煙酸、維生素C、蛇麻脂醇、甘露醇、β-谷甾醇等營養(yǎng)及功能成分，冬瓜中除含有17種常見氨基酸以外，還含有鳥氨酸和γ-氨基丁酸，是果蔬中唯一不含脂肪的食品。腌制冬瓜，俗稱臭冬瓜，是浙江東部地區(qū)深受人們喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，近年來作為“家鄉(xiāng)菜”“特色菜”身價倍增。在浙東地區(qū)民間有不同的加工方法，引起產(chǎn)品的口感、風(fēng)味帶來差異，但對其化學(xué)成分的差異性未能深入認(rèn)識，從而影響工業(yè)化生產(chǎn)工藝的建立。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)在食品質(zhì)量和安全控制方面有很重要的應(yīng)用[2]。運(yùn)用GC-MS分析方法對在魚腥草、椒樣薄荷、杏鮑菇、杏葉、香茅草、胡椒花等揮發(fā)性成分已有研究報道[3-8]。然而，GC-MS分析方法結(jié)合指紋圖譜技術(shù)在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用還不是很普遍, 它可對食品質(zhì)量和風(fēng)味等的鑒定提供參考數(shù)據(jù)。斯林林[9]用GC-MS指紋圖譜研究山蒼子油化學(xué)成分。李育鐘[10]利用GC-MS色譜指紋圖譜研究皺皮木瓜有機(jī)酸提取純化的工藝。孫蓮等[11]建立新疆蕪菁子藥材揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜,為蕪菁子藥材的質(zhì)量評價和鑒定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。阿吉姑·阿布都熱西提等[12]建立了新疆巴旦杏仁油脂肪酸成分的GC-MS指紋圖譜。而固相微萃取技術(shù)(簡稱SPME)作為一種簡單、快速、方便的樣品前處理技術(shù)其最小檢測限可在10-12～10-9數(shù)量級，近年來國內(nèi)外學(xué)者采用SPME技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境(水、土壤、大氣)、食品、天然產(chǎn)物、制藥、生物、毒理和法醫(yī)學(xué)等多個方面[13]。如利用固相微萃取技術(shù)、SPME-GC/MS聯(lián)用技術(shù)等對蟠桃鮮果、陳皮、脆肉鯇魚肉、苦蕎、乳和番茄、新疆風(fēng)干牛肉、草莓和精武鴨脖的揮發(fā)性成分做了分析[14-22]。結(jié)合氣味指紋圖譜方法能較好地反映食品中揮發(fā)性氣味物質(zhì)與其品質(zhì)變化的關(guān)聯(lián)性。前期研究表明[23]，采用同時蒸餾萃取(SDE法)和頂空固相微萃取(HS-SPME法)萃取腌制冬瓜揮發(fā)性成分，其種類和相對含量的結(jié)果具有較大的差異性，采用后者的方法能更全面反映腌冬瓜的揮發(fā)性成分。袁曉陽等研究了自然發(fā)酵腌冬瓜的菌種多樣性及其主要風(fēng)味成分[24]，其中檢測到的揮發(fā)性風(fēng)味成分包括丁酸、己酸和戊酸等，大多具有不愉快的氣味。

本文利用SPME和GC-MS分析技術(shù)，研究低鹽條件下浙東地區(qū)兩種典型的冬瓜腌制方式(生腌和熟腌)其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的差異性，并構(gòu)建和比較不同加工方式其揮發(fā)性風(fēng)味成分的指紋圖譜，以全面了解各種腌冬瓜產(chǎn)品的風(fēng)味差異性，揭示浙東地區(qū)特色腌冬瓜產(chǎn)品風(fēng)味特征，為促進(jìn)傳統(tǒng)腌冬瓜加工產(chǎn)業(yè)技術(shù)升級，提高人們飲食健康與食品營養(yǎng)等提供依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

浙東老冬瓜一只(購于寧波市菜市場)，食用鹽。

1.2 主要儀器

瓷壇、研缽、電磁爐、手動SPME 進(jìn)樣器，15毫升頂空瓶；電子稱：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；PDMS 75 μm萃取頭：Supelco公司；GC-MS儀：QP2010，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冬瓜腌制工藝流程

具體操作方法根據(jù)前期方法進(jìn)行[25]。

1.3.2 樣品的分析方法

樣品的準(zhǔn)備：在生腌冬瓜壇和熟腌冬瓜壇中分別取樣,將樣品混合均勻搗碎。分別準(zhǔn)確稱取2 g樣品液置于15 mL頂空樣品瓶中，蓋上含隔墊的蓋子，置于恒溫水浴鍋中保溫15 min。

生腌和熟腌樣品瓶分別制備兩個，將固相微萃取器的萃取針頭通過瓶蓋的橡皮墊插入樣品瓶中,推出纖維頭(注意不要使萃取頭碰到品) ,于50 ℃恒溫吸附40 min,抽回纖維頭并拔出萃取針頭。迅速將萃取針頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口,推出纖維頭,于250 ℃解析10 min,抽回纖維頭后拔出萃取頭,同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

樣品的GC-MS分析： 色譜條件：日本島津GCMS-QP2010，色譜柱為VOCO1 0.32 mm×1.8 mm×60 cm載氣為高純氮?dú)?，不分流進(jìn)樣；起始溫度35 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升溫至40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至210 ℃，保持25 min。

質(zhì)譜條件：電離源為EI或CI，離子阱溫度150 ℃，GC-MS傳輸線溫度250 ℃，質(zhì)譜掃描范圍45～1 000 amu，EI電子能量為70 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腌制冬瓜樣品揮發(fā)性成分的鑒定及種類和含量分析

2.1.1 腌制冬瓜樣品的氣相色譜分離圖譜

兩種不同腌制方法(生腌和熟腌)腌制出的冬瓜其揮發(fā)性風(fēng)味化合物通過氣相色譜法進(jìn)行分析測定，結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 生腌冬瓜樣品揮發(fā)性成分的氣相色譜圖

圖2 熟腌冬瓜樣品揮發(fā)性成分的氣相色譜圖

2.1.2 生腌冬瓜揮發(fā)性成分的SPME-GC/MS鑒定結(jié)果及各化合物的相對含量

對總離子流色譜圖中各色譜峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖, 經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索, 人工譜圖解析, 按各色譜峰的質(zhì)譜圖與文獻(xiàn)核對, 并查對有關(guān)質(zhì)譜文獻(xiàn), 確定出生腌冬瓜的風(fēng)味物質(zhì)組成, 并應(yīng)用峰面積歸一化法確定它們的相對含量, 結(jié)果如表1、表2所示。

表1列出了相似度高于80的物質(zhì)。通過表1可以看出,生腌冬瓜揮發(fā)性物質(zhì)類別主要以醇類物質(zhì)為主。其中共鑒定出醇類物質(zhì)14種,烯類物質(zhì)12種,烷烴類物質(zhì)9種,醛類10種，酸類物質(zhì)12種，酯類物質(zhì)7種；除此之外,還有少量醚、酮類、炔烴類物質(zhì)和其他物質(zhì)。各類揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量及含量占總揮發(fā)性物質(zhì)的比例如表2所示。

表1 生腌冬瓜的揮發(fā)性成分及其相對含量

表2 生腌冬瓜主要揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量

由表2可以看出，醇類物質(zhì)是構(gòu)成生腌冬瓜揮發(fā)性成分的主要物質(zhì)，其相對含量占總揮發(fā)性成分含量的46.70%；烯烴和酯對生腌冬瓜揮發(fā)性成分的貢獻(xiàn)僅次于醇類,烯烴類物質(zhì)種類多于酯類物質(zhì),但其相對含量卻遠(yuǎn)低于酯類,其含量占總量的10.51%，酯類物質(zhì)含量占總量的26.63%。醇類物質(zhì)中,異戊醇含量較高,為17.54% ,占醇類物質(zhì)含量的37.56% ,乙醇相對含量為22.12% ,其它醇含量均較低；酯類物質(zhì)中，以乙酸乙酯的含量較高，其相對含量為89.6%，其余物質(zhì)的相對含量較低；烯烴類物質(zhì)中以(Z)-2-庚烯含量較高,其余含量均較低,且含量相當(dāng)；烷烴中三硅氧烷為主,其余含量均較低,且含量相當(dāng)。

2.1.3 熟腌冬瓜揮發(fā)性成分的SPME-GC/MS鑒定結(jié)果及各化合物的相對含量

對總離子流色譜圖中各色譜峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖, 經(jīng)過檢索與核對,確定出熟腌冬瓜的風(fēng)味物質(zhì)組成, 并應(yīng)用峰面積歸一化法確定了它們的相對含量, 結(jié)果如表3和表4所示。

表3列出了相似度高于80的物質(zhì)。通過表3可以看出,熟腌冬瓜揮發(fā)性物質(zhì)類別主要以烯烴類物質(zhì)為主。其中共鑒定出醇類物質(zhì)10種,烯類物質(zhì)8種,烷烴類物質(zhì)13種,醛類14種，酸類物質(zhì)14種；除此之外,還有少量呋喃、酯類、酮類和其他物質(zhì)。各類揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量及含量占總揮發(fā)性物質(zhì)的比例見表4。

表3 熟腌冬瓜的揮發(fā)性成分及其相對含量

續(xù)表3

表4 熟腌冬瓜主要揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量

由表4可以看出,烯烴類物質(zhì)是構(gòu)成熟腌冬瓜揮發(fā)性成分的主要物質(zhì),其相對含量占總揮發(fā)性成分含量的61.71%；酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)對熟腌冬瓜揮發(fā)性成分的貢獻(xiàn)僅次于烯烴類,酸類和醛類物質(zhì)種類多于烯烴類物質(zhì),但其相對含量卻遠(yuǎn)低于烯烴類,其含量分別占總含量的10.82%，8.5%，4.07%，7.09%；烷烴與酮類物質(zhì)對冬瓜香味也具有一定貢獻(xiàn)。烯烴類物質(zhì)中,2,4-戊二烯含量較高,為47.46% ,占烯烴類物質(zhì)含量的76.91% ,庚烯相對含量為9.25% ,其它烯烴類物質(zhì)含量均較低；酯類物質(zhì)中以乙酸乙酯含量較高,為10.71%，其余含量均較低,且含量相當(dāng)；烷烴中以3-亞甲基-庚烷為主,相對含量分別為2.1%；2-乙基-1-己醇是構(gòu)成冬瓜香味的主要醇類物質(zhì), 相對含量為4.07%。

2.1.4 生腌冬瓜和熟腌冬瓜主要揮發(fā)性成分及其相對含量的對比

由生腌冬瓜和熟腌冬瓜的揮發(fā)性成分可以看出，生腌冬瓜中醇類物質(zhì)是構(gòu)成揮發(fā)性成分的主要物質(zhì)，而在熟腌冬瓜中，烯烴類物質(zhì)是構(gòu)成揮發(fā)性成分的主要物質(zhì)。

在生腌冬瓜的揮發(fā)性成分中，其相對百分含量較高的7種物質(zhì)分別是乙醇(10.33%)、乙酸乙酯(23.86%)、異戊醇(17.54%)、2-甲基-1-丁醇(8.49%)、3-甲基-1-丁醇(7.03%)、(Z)-2-庚烯 (5.98%)、2,4-戊二烯(2.46%)，7種化合物的總含量占所有化合物75.69%。

在熟腌冬瓜的揮發(fā)性成分中，其相對百分含量較高的7種物質(zhì)是：乙酸乙酯(10.71%)、2,4-戊二烯(47.46%)、庚烯(9.25%)、2-乙基-1-己醇(4.07%)、2-辛烯(4.12%)、戊醛(2.42%)、3-亞甲基-庚烷(2.1%)，7種化合物的總含量占所有化合物的80.13%。

2.2 色譜指紋圖譜的建立與分析

2.2.1 生腌冬瓜的色譜指紋圖譜的建立與分析

對生腌冬瓜的兩組樣品進(jìn)行測定, 共鑒定出揮發(fā)性成分77種, 主要成分是醇類、烯類和酯類等化合物。從中選取11個共有峰作為可以構(gòu)成生腌冬瓜風(fēng)味的特征指紋峰, 共有指紋峰的峰面積占總峰面積72.84%。以乙烷(保留時間為7.595 )內(nèi)標(biāo)峰為參照峰求出共有指紋峰的相對保留值和相對峰面積Sr值，并按相對保留值的大小順序列表(表5) , 建立起生腌冬瓜的色譜指紋圖譜(圖3)。

表5 兩組生腌冬瓜的色譜指紋圖譜中特征峰的相對保留值和Sr值

圖3 生腌冬瓜的色譜指紋圖譜

兩次鑒定的生腌冬瓜的總離子流色譜圖既有相似的特征, 又有差別。他們的揮發(fā)性成分的色譜峰基本相同, 但每個峰的含量卻有所不同，第一次鑒定中，1、2、3、4、5峰的相對百分含量均較大。第二次鑒定中，6、7、8、9、10、11峰的相對百分含量較大。兩次鑒定中第5峰處的峰都較密集, 而且其百分含量差異性不大。

由表5可以看出, 2,4-戊二烯、3-甲基-1-丁醇、(Z)-2-庚烯的相對百分含量存在著一定的差異，二次鑒定中的含量較高, 而一次鑒定中的含量較低, 其余化合物的相對百分含量則差異不大。

2.2.2 熟腌冬瓜的色譜指紋圖譜的建立與分析

對熟腌冬瓜的兩組樣品進(jìn)行測定, 共鑒定出揮發(fā)性成分77種, 主要成分是烯烴類和酯類等化合物。從中選取了7個共有峰作為構(gòu)成熟腌冬瓜風(fēng)味的特征指紋峰, 共有指紋峰的峰面積占總峰面積79.73%。以戊醛(保留時間為15.593)內(nèi)標(biāo)峰為參照峰求出共有指紋峰的相對保留值和相對峰面積Sr值，并按相對保留值的大小順序列表(表6) , 建立起熟腌冬瓜的色譜指紋圖譜(圖4)。

表6 兩組熟腌冬瓜的色譜指紋圖譜中特征峰的相對保留值和Sr值

二次鑒定的熟腌冬瓜的總離子流色譜圖既有相似的特征又有差別，他們的揮發(fā)性成分的色譜峰基本相同, 但每個峰的含量卻有所不同，第一次鑒定中，1、5、6、7峰的相對百分含量均較大；第二次鑒定中3、4、6峰的相對百分含量較大。兩次鑒定中第二次鑒定的峰較密集, 但其百分含量差異性不大。

2.2.3 生腌冬瓜和熟腌冬瓜色譜指紋圖譜的對比

綜上可知，在兩次鑒定中，生腌冬瓜的共有峰多于熟腌冬瓜的共有峰，生腌冬瓜有11個共有峰，而熟腌冬瓜有7個共有峰，且生腌冬瓜中第5峰處的峰都比較密集，而熟腌冬瓜的共有峰則分布相對均勻。

在生腌冬瓜中，2,4-戊二烯、3-甲基-1-丁醇、(Z)-2-庚烯的相對百分含量存在著一定的差異，且差異性較大，但熟腌冬瓜中各化合物的相對百分含量的差異性不大，說明熟腌冬瓜的揮發(fā)性化合物相比生腌冬瓜的揮發(fā)性化合物較穩(wěn)定。

圖4 熟腌冬瓜的色譜指紋圖譜

3 討 論

研究表明冬瓜兩種腌制過程揮發(fā)性成分存在較大差異，生腌冬瓜以醇類相對含量最高占46.7%，其次為酯類占26.6%；而熟腌工藝相對含量最高為烯烴類占61.7%，其次是酯類、醇類和醛類相對含量較接近，在10%左右；這與腌制操作方式密切相關(guān)。對于生腌工藝，生鮮原料直接經(jīng)清洗后，其中帶有的各種各樣微生物包括耐熱和非耐熱微生物，根據(jù)冬瓜原料的營養(yǎng)成分及其環(huán)境條件，通過微生物在食品介質(zhì)的消長規(guī)律進(jìn)行，產(chǎn)生特有的微生物菌相，而這些微生物種群與產(chǎn)品質(zhì)量密切相關(guān)。在前期研究中，沈錫權(quán)等[26]發(fā)現(xiàn)，以生腌方式腌制冬瓜，開始階段其優(yōu)勢細(xì)菌種類為腸桿菌屬、乳球菌屬和魏斯氏菌屬，到腌制中期階段，微生物多樣性相對穩(wěn)定，主要優(yōu)勢細(xì)菌有片球菌屬、魏斯氏菌屬和枝芽孢桿菌屬。這些種群由于代謝途徑包括有機(jī)酸、醇等代謝產(chǎn)物的差異性最后影響到腌冬瓜的風(fēng)味成分，從而形成生腌冬瓜的特定品質(zhì)。

相對熟腌加工工藝，冬瓜原料經(jīng)過約5分鐘時間的煮沸，其中不耐熱微生物包括酵母菌和細(xì)菌顯著減少，從而大大影響起始階段的微生物種群及其數(shù)量。趙永威等采用分子生物學(xué)方法研究了冬瓜熟腌工藝微生物的多樣性[27]，發(fā)現(xiàn)冬瓜腌制開始時優(yōu)勢種群為不動桿菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬和腸桿菌屬；這與生腌工藝中除了細(xì)菌魏斯氏菌屬相同外，微生物種群產(chǎn)生較大的差異性；在腌制中期至后期存在的部分菌種乳桿菌屬和葡萄球菌屬與生腌菌屬存在差異性；不同菌種的發(fā)酵體系必然引起代謝產(chǎn)物的差異性，其中的有機(jī)酸、醇類通過后熟階段形成多種揮發(fā)性成分。另外，腌制冬瓜中存在重要微生物乳酸菌、酵母菌通過代謝形成乳酸及抗菌成分對維持產(chǎn)品的菌屬穩(wěn)定性具有重要意義。張慶峰等[28]通過接種復(fù)合乳酸菌的新型冬瓜腌制工藝，通過接入乳酸菌后相比于自然腌制冬瓜，發(fā)酵穩(wěn)定后其乳酸菌和細(xì)菌總數(shù)明顯提高達(dá)1個數(shù)量級，產(chǎn)品含有的氨基酸總量和必需氨基酸含量相對提高；其揮發(fā)性成分的種類及含量與對照組有較高的相似度，其中酯類和醛類物質(zhì)相對含量分別提高了10.00%和29.88%。綜上所述，產(chǎn)生這此結(jié)果的原因與微生物種群變化有密切的關(guān)系。張勝男等[29]通過篩選優(yōu)良乳酸菌用于提高腌制茭白的品質(zhì)同樣證明了這些觀點(diǎn)。而孫麗等[30]考察了熟腌冬瓜加工過程酵母菌的多樣性，其中檢測到的優(yōu)勢酵母菌為普魯蘭類酵母和熱帶假絲酵母，而普魯蘭類酵母能促進(jìn)部分乳酸菌生長，熱帶假絲酵母抗逆性強(qiáng)，能代謝木糖產(chǎn)生乙醇，這些種群通過不同的代謝方式產(chǎn)生多種揮發(fā)性成分對產(chǎn)品風(fēng)味的形成發(fā)生重要影響[31]。

4 結(jié) 論

腌制冬瓜所采用的工藝不同，其揮發(fā)性成分和指紋圖譜也有所不同。生腌冬瓜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要由醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)構(gòu)成。醇類物質(zhì)的相對含量占總含量的46.70%，其中乙醇相對含量為10.33%，異戊醇相對含量為17.54%，2-甲基-1-丁醇相對含量為8.49%。酯類物質(zhì)相對含量占總含量的26.63%，其中乙酸乙酯的相對含量為23.86%。熟腌冬瓜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要由烯烴類和酯類物質(zhì)構(gòu)成。烯烴類物質(zhì)相對含量占總含量的61.71%，其中2,4-戊二烯相對含量為47.46%，庚烯相對含量為9.25%。酯類物質(zhì)相對含量占總含量的10.82%，其中乙酸乙酯的相對含量為10.81%。生腌冬瓜和熟腌冬瓜中酯類物質(zhì)的含量都位居第二，說明不論在生腌冬瓜還是熟腌冬瓜中，酯類物質(zhì)都是腌制冬瓜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的一個重要組成部分。

由生腌冬瓜的色譜指紋圖譜可以看出，生腌冬瓜中2,4-戊二烯、3-甲基-1-丁醇、(Z)-2-庚烯的相對百分含量存在著一定的差異，且差異性較大。而由熟腌冬瓜的色譜指紋圖譜可以看出，熟腌冬瓜中的各揮發(fā)性物質(zhì)的百分含量差異性都不大，這說明，熟腌冬瓜相對于生腌冬瓜其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)更加穩(wěn)定。