代麗娟，宋立群，贠捷，張德欣，于思明，馬艷春

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

腎纖維化是慢性腎臟病(CKD)進(jìn)展至終末期腎臟病(ESRD)的重要因素[1]。目前CKD的發(fā)病率逐年上升，為9%～13%[2],若進(jìn)展至ESRD，患者需行腎臟替代治療,導(dǎo)致社會和個人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)沉重。腎纖維化包括三個方面：腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化、腎血管纖維化。其主要的病理特征為進(jìn)行性細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)堆積。形成腎纖維化的病理機(jī)制與多種環(huán)節(jié)密切相關(guān)，如炎性反應(yīng)、腎臟固有細(xì)胞及免疫細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、生長因子、細(xì)胞因子失衡等[3-6]。西醫(yī)學(xué)抗腎纖維化的研究主要通過建立腎纖維化的動物模型及誘導(dǎo)體外細(xì)胞培養(yǎng)，目前仍處于臨床實驗階段，主要應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、肝細(xì)胞生長因子、抗TGF-β抗體、吡非尼酮、舒拉明等藥物治療，臨床研究尚不盡成熟，臨床療效亦不十分理想。而中醫(yī)學(xué)注重整體觀念，辨證論治，中醫(yī)藥治療在延緩腎纖維化進(jìn)程的臨床應(yīng)用中取得一定的療效。大量研究證實，單味中藥及中藥提取物可從多個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，從而防治腎纖維化，如雷公藤多苷、積雪草苷、黃芩素、五味子乙素等[7]，揭示了中藥及中藥提取物在抗腎纖維化中發(fā)揮的重要作用。本文擬就蟲草素干預(yù)多種信號通路防治腎纖維化的臨床研究進(jìn)展作一綜述。

1 腎纖維化的發(fā)病機(jī)制

腎纖維化可由多種慢性腎臟病導(dǎo)致，亦是多種因素驅(qū)動的病理過程。多種致病因子作用于各相關(guān)信號通路，可誘導(dǎo)ECM大量堆積，ECM逐漸增多，腎小球細(xì)胞反復(fù)受損，腎小管萎縮等，均可促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生發(fā)展。

1.1 轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β) TGF-β是主要的啟動腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(TEMT)的生長因子[8]。其中以TGF-β1最重要，可激活WNT信號通路和TGF-β/Smad信號通路，啟動腎纖維化病理機(jī)制[9-10]。

1.2 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) 約35%的活躍成纖維細(xì)胞來源于EMT[11]。腎小管上皮細(xì)胞 (TECs)在TGF-β的誘導(dǎo)下，發(fā)生 TEMT，可遷移臨近的腎間質(zhì)與實質(zhì)。EMT可激活成纖維細(xì)胞，增加纖維連接結(jié)蛋白(FN)和膠原合成，使ECM大量堆積[12]。

1.3 細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) ECM廣泛存在于腎間質(zhì)中成纖維細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中，并在其中合成分泌[13]。通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)系統(tǒng)，抑制使MMPs表達(dá)降低或活性下降，可引起ECM降解減少，從而造成ECM異常沉積。越多的ECM聚集到腎小球系膜區(qū)，則更加重腎小球硬化[14]。

1.4 其他細(xì)胞因子 包括內(nèi)皮素-1(ET-1) 、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)、骨形成蛋白-7(BMP-7)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(TCF/LEF)、整合素連接激酶(ILK) 、結(jié)締組織生長因子(CTGF) 、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1) 、血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1) 、腫瘤壞死因子α(TNF-α) 、細(xì)胞黏附分子、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等，都與腎纖維化的形成密切相關(guān)[3]。

2 蟲草素抗腎纖維化

冬蟲夏草，性甘味平，功效在于補(bǔ)肺益腎，益氣填精，以補(bǔ)益腎氣為主。《本草從新》中首次記載了冬蟲夏草“保肺益腎，止血化痰，已勞嗽”。《柑園小識》提到“以酒浸數(shù)枚啖之，治腰膝間痛楚，有益腎之功”，強(qiáng)調(diào)其益腎之功。慢性腎臟病患者多以本虛標(biāo)實為主，本虛多為腎虛，臨床中應(yīng)用冬蟲夏草及其中成藥制劑治療慢性腎臟病，亦取得較好療效。蟲草素又稱為蟲草菌素，蛹蟲草菌素，為中藥冬蟲夏草中提取出的活性有效成分，其化學(xué)名為3,-脫氧腺苷，為一種核苷類抗生素,分子式為C10H13N5O3，相對分子量為251[15]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蟲草素具有抑制腎間質(zhì)中成纖維細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞纖維化的作用，可減輕炎性細(xì)胞浸潤、抑制腎小球系膜區(qū)、腎間質(zhì)ECM聚集及免疫復(fù)合物沉積，因此可保護(hù)腎組織[16-17]。

2.1 蟲草素調(diào)控TGF-β/Smad信號通路 在TGF-β/Smad信號通路中，TGF-β作為促纖維化因子可與相應(yīng)受體結(jié)合，并啟動TGF-β/Smad信號通路誘導(dǎo)Smad2/3磷酸化，形成p-Smad2/3。p-Smad2/3與Smad4結(jié)合向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)多種促纖維化因子靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，形成或加重腎纖維化。ILK[18]是一種存在于細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為連接細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)兩者間的重要分子成分，故可調(diào)節(jié)ECM聚集。ILK亦是TGF-β/Smad信號通路中生物效應(yīng)的下游分子,可參與FN的合成及EMT的過程。顧劉寶等[19]研究表明，蟲草素抗腎纖維化作用與抑制TGF-β/Smad信號通路有關(guān)，其主要作用靶點是降低Smad磷酸化水平，而非干預(yù)Smad蛋白合成。蟲草素能夠有效抑制Smad2/3 蛋白磷酸化，減少下游I型、IV型膠原蛋白表達(dá)，梁澤智等[20]采用高糖誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞發(fā)生腎小管間質(zhì)化(EMT)，研究表明蟲草素對α-SMA mRNA及蛋白水平、TGF-β有明顯抑制作用，同時上調(diào)E-cadherin mRNA翻譯及蛋白合成，因而拮抗處理的NRK-49F細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，抑制EMT。還有研究表明，蟲草素可通過抑制HGF表達(dá)，抑制TGF-β、α-SMA及蛋白，從而抑制TGF-β/Smad信號通路、下調(diào)FN的表達(dá)，調(diào)節(jié)腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生抗纖維化的作用[21]。Mc Gonigle等[22]發(fā)現(xiàn)，eIF2α作為TGF-β及其信號通路的上游因子，磷酸化后可調(diào)控其信號傳導(dǎo)過程。蟲草素促進(jìn)eIF2α磷酸化，與TGF-β受體結(jié)合，使翻譯受阻，影響下游信號傳導(dǎo)，最終阻斷Smad信號通路，緩解腎纖維化。因此，蟲草素可通過介導(dǎo)TGF-β、eIF2α、Smad2/3蛋白、HGF、α-SMA及蛋白，抑制eIF2α/TGF-β/Smad 信號通路的傳導(dǎo)，達(dá)到抗腎臟纖維化的作用。

2.2 蟲草素調(diào)控TGF-β/Snail信號通路 在TGF-β/Snail信號通路中，激活鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail) 使腎小管上皮細(xì)胞EMT聚積，而TGF-β和氧化應(yīng)激等是Snail信號通路激活的重要因素。蟲草素能有效抑制高糖導(dǎo)致的TGF-β表達(dá)上調(diào)和腎小管上皮細(xì)胞EMT。Snail是E- caherin 轉(zhuǎn)錄中重要抑制基因，通過抑制 E-caherin 的表達(dá)，下調(diào)緊密連接蛋白(Clau- dins) 、閉合蛋白(Occludins)及附膜蛋白(Muc1)等表面蛋白，激活FN及基質(zhì)金屬蛋白-9(MMP-9)的表達(dá)，最終誘導(dǎo)EMT。陳結(jié)慧等研究結(jié)果顯示，蟲草菌液可下調(diào)TGF-β1、α-SMA表達(dá)及Snail1信號蛋白表達(dá)，并且激活E-cadherin，使膠原纖維沉積減少。這表明蟲草制劑中有效成分可通過抑制TGF-β1/Snail1 信號通路的傳導(dǎo)而抑制糖尿病小鼠EMT[23]。

2.3 蟲草素調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路 在mTOR信號通路中，mTOR是連接細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶，mTOR信號通路參與腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制[24]。有人[25]應(yīng)用UUO模型研究，四甲基哌啶氮氧化物(Tempol) 抗氧化劑可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的傳導(dǎo)，對腎臟起到保護(hù)作用，防治腎纖維化。Ma等[26]研究表明，在腎纖維化模型中PI3K、Akt與mTOR蛋白磷酸化水平明顯升高，PI3K/Akt/mTOR信號通路激活。高血糖可誘導(dǎo)糖尿病患者上調(diào)Akt，激活A(yù)kt/mTOR信號通路，促使ECM聚集，抑制單磷酸腺苷活化蛋白激酶 (AMPK)，此為引起腎小球肥大、基底膜增厚、足細(xì)胞損傷的病理機(jī)制之一，并導(dǎo)致腎功能損傷[27]。蟲草素可通過阻斷IκBα降解，抑制Akt和p38激酶的磷酸化，抑制NF-κB活性，抑制炎性因子NO、PGE2。在PI3K/Akt/mTOR 信號通路中，蟲草素通過抑制Akt來抑制信號傳導(dǎo)，達(dá)到抗腎纖維化的作用[28]。

2.4 蟲草素調(diào)控AMPK/mTOR信號通路 AMPK/mTOR信號通路是調(diào)控細(xì)胞自噬的重要途徑。細(xì)胞自噬通過參與細(xì)胞生長，增殖和凋亡相關(guān)的多種信號傳導(dǎo)過程，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的損傷和凋亡。自噬激活依靠的主要細(xì)胞學(xué)標(biāo)志為LC3，LC3是位于前自噬泡和自噬泡膜表面的自噬激活調(diào)控因子，是通過AMPK/mTOR信號通路來參與腎纖維化的進(jìn)程。LC3主要有LC3-I和LC3-Ⅱ兩種亞型，細(xì)胞自噬泡膜多由LC3-Ⅱ標(biāo)記。AMPK作為細(xì)胞的能量識別受體，可識別機(jī)體能量調(diào)節(jié)變化，mTOR激酶參與AMPK/mTOR信號傳導(dǎo)，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵信號分子，受到營養(yǎng)剝奪、胰島素和其他生長因子的影響，細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)可觸發(fā)該自噬途徑?；罨腁MPK負(fù)調(diào)節(jié)mTOR，當(dāng)細(xì)胞營養(yǎng)缺乏時，PI3K/AMP依賴的AMPK信號通路激活，最終激活mTOR，抑制細(xì)胞自噬的啟動[29]。徐喆等[30]應(yīng)用鏈脲佐菌素腹腔內(nèi)注射復(fù)制糖尿病腎病(DN)大鼠模型，其研究表明冬蟲夏草提取物可通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路的傳導(dǎo)，下調(diào)標(biāo)記蛋白LC-3II的含量，有效抑制腎小管細(xì)胞自噬啟動，減緩腎小管細(xì)胞的損傷。

2.5 蟲草素調(diào)控p38MAPK信號通路 p38MAPK信號通路參與腎小球系膜細(xì)胞損傷的形成，通過激活磷酸化p38MAPK，刺激p38MAPK信號通路傳導(dǎo)，在分子水平上加快腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。基因 megsin表達(dá)后可加重系膜細(xì)胞增殖和(或)腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張伴腎間質(zhì)損傷，在腎纖維化中起關(guān)鍵作用。宋立群等[31]研究表明，高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞(HMC)內(nèi)p38MAPK、megsin mRNA表達(dá)升高，與高糖組比較，蟲草益腎顆粒劑量組p38MAPK、megsin mRNA表達(dá)下調(diào)。據(jù)此可推測蟲草素可通過抑制高糖誘導(dǎo)的HMC中p38MAPK、 p-p38MAPK，抑制p38MAPK信號通路的傳導(dǎo)、抑制megsin mRNA的表達(dá)、megsin 的合成和分泌，起到延緩腎纖維化進(jìn)展的作用。

2.6 蟲草素調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin信號通路可在多種糖尿病腎病動物模型介導(dǎo)腎臟纖維化。Wnt蛋白、受體Frizzled、共受體LRP5結(jié)合成三聚體，可抑制細(xì)胞質(zhì)中β-catenin磷酸化、防止β-catenin降解，影響Wnt/β-catenin信號通路的傳導(dǎo)。在細(xì)胞核中β-catenin與 T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(TCF/LEF)相互作用，對c-myc、cyclinD1、VEGF、FN、FGF等基因轉(zhuǎn)錄翻譯具有重要調(diào)控作用[32]。DKK1是 Wnt 信號通路的重要內(nèi)源抑制劑，與LRP5/6、穿膜蛋白kremen1/2三者結(jié)合，激活 Wnt信號下游 Twist、LEF1、c-myc、纖連蛋白的表達(dá)，形成或促進(jìn)腎纖維化[33-34]。有研究[35]發(fā)現(xiàn)，DKK1通過介導(dǎo)高糖誘導(dǎo) β-catenin 磷酸化和減少β-catenin 水平，促進(jìn)促纖維化因子包括TGF-β/FN的表達(dá)。應(yīng)用 DKK1-AS能抑制糖尿病大鼠尿蛋白的排泄及抗腎臟系膜細(xì)胞纖維化。研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草有效成分可抑制糖尿病大鼠模型β-catenin蛋白的分解、DKK1mRNA 及蛋白表達(dá)，介導(dǎo)Wnt/β-catenin，具有非依賴降糖的腎臟保護(hù)作用。故DKK1是冬蟲夏草有效成分在抗腎纖維化的重要作用靶點[36-37]。

2.7 蟲草素調(diào)控PPARγ/RARs信號通路 過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一種細(xì)胞核受體，由三種亞型PPARα、PPARβ、PPARγ組成。PPARγ受體和RARs受體結(jié)合形成二聚體后參與多種細(xì)胞生理過程，和多種腎臟疾病的發(fā)展相關(guān)。PPARγ激動劑羅格列酮能明顯降低糖尿病大鼠腎小球和腎間質(zhì)病變[38]，降低IgA腎病大鼠腎臟組織PCNA、TGF-β1、ATR1、ICAM-1的表達(dá)，減輕腎臟病變[39-40]。PPARγ激活后能明顯抑制腎小球系膜細(xì)胞分泌α-SMA和Col-Ⅳ[41]。激活的PPARγ同時抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞PI3K/AKT信號通路。血小板源性生長因子(PDGF)可激活PI3K/AKT信號通路活化MMP2，MMP2通過降解非纖維結(jié)構(gòu)樣膠原并裂解彈性蛋白以釋放具有生物活性的ECM，啟動腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生，蟲草素屬真菌類新型植物雌激素(PE)，可活化PPARs，調(diào)控PPARγ/RARs信號通路，發(fā)揮抗腎纖維化的作用[42]。

以上7種信號通路相互關(guān)聯(lián)，TGF-β作為Smad信號通路和Snail信號通路中重要的致病因子可下調(diào)DKK1,同時激活Wnt/β-catenin信號通路。Wnt通路激活時，信號傳導(dǎo)至下游TCF/LEF、c-myc、纖連蛋白，可激活PPARγ/RARs信號通路，形成或促進(jìn)腎纖維化。在Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)過程中，可抑制 GSK3-β，又可穩(wěn)定Smad3 。Smad3可幫助 β- catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)移，兩種信號相互促進(jìn)。在PI3K/Akt/mTOR信號通路中，抑制GSK3-β，可調(diào)控TSC1/2、TBC1D7，介導(dǎo)AMPK/mTOR信號通路。TGF-β1可上調(diào)AKT、 ARK5的磷酸化，激活PI3K/AKT 信號通路，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，促進(jìn)Snail核內(nèi)轉(zhuǎn)移。PPARγ作用于TGFβ/smad信號通路中阻遏因子c-Ski，阻斷TGFβ/smad信號傳導(dǎo)。激活wnt信號通路可下調(diào)PPARγ,及 m R N A 表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。TGF-β1在非Smad通路中可上調(diào) PAI-1的表達(dá)，同時可激活p38 MAPK。mTOR可介導(dǎo)AMPK/mTOR和PI3K/Akt/mTOR信號通路。

3 現(xiàn)狀與展望

通過現(xiàn)有相關(guān)研究可見蟲草素抗腎纖維化作用機(jī)制并不單一。蟲草素可通過抑制HGF表達(dá)，抑制TGF-β、促進(jìn)TGF-β及其信號通路的上游因子eIF2α磷酸化，下調(diào)Snail 1 信號蛋白表達(dá)，并且激活E-cadherin，阻斷 IкBα降解，抑制 Akt和 p38激酶的磷酸化，抑制 NF-кB活性，抑制炎性因子 NO、PGE2，下調(diào)標(biāo)記蛋白LC-3II的含量以抑制細(xì)胞自噬啟動，抑制p38MAPK、 p-p38MAPK，抑制megsin mRNA 的表達(dá)、megsin的合成和分泌，抑制DKK1mRNA及蛋白表達(dá)活化PPARγ。蟲草素通過作用于多種信號通路抑制腎纖維化，多種信號通路之間協(xié)同作用，相互關(guān)聯(lián)，同時通過多種途徑抑制腎臟纖維化的進(jìn)程。