葉 婷，崔雅萍，梁林金，梁文儀，簡 平，周 坤，吳玲芳，李 師，亓 旗，張?zhí)m珍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488）

大三果由訶子、毛訶子和余甘子3味藥組成，3種果實(shí)常配伍使用，或以它們?yōu)橹魉幣湮闉槿麥?，三果湯等劑型，故簡稱大三果[1]。大三果最早見于藏醫(yī)藥《四部醫(yī)典》[2]，1995年版藏藥部頒標(biāo)準(zhǔn)將其收載[3]。隋唐時(shí)期經(jīng)印度傳入我國，據(jù)記載，大三果已被用于印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)超過1000余年。在阿育吠陀傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，大三果可以促進(jìn)疾病的恢復(fù)與痊愈，具有保健作用，應(yīng)用十分廣泛[4-6]。大三果主要含有鞣質(zhì)類、酚酸類、三萜酸類及黃酮類等化合物，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)大三果在抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、抗菌、抗炎、強(qiáng)心、保肝、化療保護(hù)等方面均表現(xiàn)出一定的治療和預(yù)防保健作用[7-11]。2015版中國藥典將沒食子酸作為指標(biāo)來評價(jià)余甘子的質(zhì)量，而對訶子、毛訶子無明確的質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，有學(xué)者對訶子[12，13]、毛訶子[14，15]及余甘子[16-18]采用HPLC法對其藥材中的多個(gè)成分（沒食子酸、鞣花酸、柯里拉京等）的含量進(jìn)行測定，也有學(xué)者采用HPLC法同時(shí)測定三果湯水提物中沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸的含量[19]。本文建立分光光度法測定總鞣質(zhì)及HPLC法同時(shí)測定大三果及其鞣質(zhì)部位中沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸等3個(gè)成分含量的方法，為大三果及鞣質(zhì)部位的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

儀器：Agilent 1100型高效液相色譜儀；Agilent chemstation b.04.03軟件；十萬分之一電子分析天平：Sartorious BT 25S型（北京賽多利斯儀器有限公司）；超聲波清洗器（功率：100 W，型號(hào)：KQ-500DE昆山超聲儀器有限公司）；紫外-可見分光光度計(jì)：TU1810（普析通用公司）；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本，型號(hào)：N-1000）。

表1 流動(dòng)相梯度

圖1 供試品與對照品HPLC譜圖

1.2 材料

藥材：余甘子、訶子和毛訶子藥材均購自北京藏醫(yī)院（產(chǎn)地尼泊爾），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥系閻玉凝教授鑒定，分別為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.、使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz.及毗黎勒 Terminalia bellirica（Gaertn.）Rox.的干燥成熟果實(shí)。沒食子酸對照品（批號(hào)17022801）、柯里拉京對照品（批號(hào)17033002）、鞣花酸對照品（批號(hào)17052603），均購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%。

試劑：甲醇（Fisher Scientific，色譜純）；蒸餾水（屈臣氏）；其他試劑均為分析純。磷鉬鎢酸試液（自制）；29%碳酸鈉溶液。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC含量測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備

沒食子酸對照品溶液：精密稱取沒食子酸對照品4.55 mg，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為沒食子酸對照品溶液。

柯里拉京對照品溶液：精密稱取柯里拉京對照品3.45 mg，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為柯里拉京對照品溶液。

鞣花酸對照品溶液：精密稱取鞣花酸對照品2.08 mg于25 mL容量瓶中，加少量二甲亞砜溶解并用50%甲醇稀釋至刻度，作為鞣花酸對照品溶液。

混合對照品溶液：精密吸取等量上述對照品溶液，混勻，制成混合對照品。

2.1.2 大三果及其鞣質(zhì)部位供試品溶液的制備

大三果供試品溶液：按1∶1∶1比例稱取三種藥材，混合，粉碎（過50目篩），混勻，為大三果供試品。取大三果粉末300 mg，精密稱定，置100 mL三角瓶中，精密加入50%甲醇60 mL，稱重，超聲60 min，補(bǔ)足減失重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

大三果鞣質(zhì)部位供試品溶液：采用課題組建立的提取純化方法，取一定量等比例余甘子、訶子以及毛訶子藥材，粉碎，提取，過大孔樹脂純化，洗脫液回收至小體積，減壓干燥，即得大三果鞣質(zhì)部位。取大三果鞣質(zhì)部位粉末21 mg，精密稱定，精密移取60 mL 50%甲醇置100 mL三角瓶中100 MHz超聲60 min，補(bǔ)足原重量，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 高效液相色譜條件

Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相A（甲醇）：（B）0.1%甲酸水，其梯度（表1）；流速為1 mL·min-1；檢測波長：270 nm。分別吸取混合對照品溶液、大三果藥材供試品溶液和大三果鞣質(zhì)部位供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，按下列流動(dòng)相梯度洗脫，色譜圖（圖1）。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取沒食子酸對照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL；柯里拉京對照品溶液4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL；鞣花酸對照品溶液4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、32 μL注入液相色譜儀。按照“2.1.3液相色譜條件”項(xiàng)下方法測定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算3種成分的回歸方程（表2）。

2.1.5精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照“2.1.3液相色譜條件”記錄峰面積，沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸色譜峰峰面積的RSD分別為0.59%、0.85%和0.30%，表明該方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

大三果供試品溶液制備后分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 進(jìn)行測定，記錄峰面積，沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸色譜峰峰面積的RSD值分別為0.32%，0.73%，0.33%。樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取大三果藥材粉末供試品300 mg，6份，精密稱定，按照“大三果供試品溶液的制備”項(xiàng)方法制備，按照“2.1.3液相色譜條件”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測定。沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸的平均含量分別為1.69%、0.58%和0.99%，RSD值分別為為0.96%、1.41%和1.37%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 回收率試驗(yàn)

2.1.8.1 大三果藥材加樣回收率試驗(yàn)

取大三果供試品150 mg，共6份，精密稱定，分別精密加入對照品溶液沒食子酸（2.53 mg·mL-1）柯里拉京（0.87 mg·mL-1），鞣花酸（1.5 mg·mL-1）1.0 mL，精密加入50%甲醇57 mL置100 mL三角瓶中，超聲60 min，補(bǔ)足失去重量，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜濾過。精密吸取供試品20 μL，按照“2.1.3液相色譜條件”項(xiàng)下測定峰面積，計(jì)算回收率及RSD值（表3）。

表2 3種成分線性關(guān)系考察

2.1.8.2 鞣質(zhì)部位加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱取沒食子酸3.3 mg置100 mL容量瓶中，柯里拉京對照品4.5 mg置于25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容。精密稱取鞣花酸對照品3.75 mg置于25 mL容量瓶中，加DMSO溶解，以50%甲醇稀釋并定容。

稱取大三果鞣質(zhì)部位粉末6份，每份約10.5 mg，分別向每一份樣品中精密加入上述對照品溶液各1.0 mL，50%甲醇定容至10 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜過濾，精密吸取20 μL進(jìn)樣，測定沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸色譜峰峰面積，計(jì)算回收率及RSD值（表4）。

表3 大三果藥材加樣回收率考察結(jié)果

表4 大三果鞣質(zhì)部位加樣回收率考察結(jié)果

表5 不同批次大三果藥材單一成分含量測定結(jié)果（n=3）

表6 不同批次鞣質(zhì)部位3種成分含量測定結(jié)果（n=3）

2.1.9 不同批次大三果藥材和鞣質(zhì)部位中指標(biāo)性成分的含量測定

稱取3個(gè)批次大三果藥材供試品粉末300 mg，精密稱定，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，按“2.1.3 高效液相色譜條件”，測定峰面積，計(jì)算含量（表5）。

稱取三個(gè)批次鞣質(zhì)部位粉末約21 mg，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇溶解后，定容至刻度，搖勻，經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，按“2.1.3高效液相色譜條件”測定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果（表6）。

2.2 總鞣質(zhì)含量測定（2015版中國藥典方法）

2.2.1 溶液制備

磷鉬鎢酸試液：按2015版藥典第四部通則8001試藥部分方法，取鎢酸鈉100 g、鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸100 mL磷酸50 mL，加熱回流10小時(shí)，放冷，再加硫酸鋰150 g、水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去殘留的溴（約15 min），冷卻，加水稀釋至1000 mL，濾過，即得。本液不得顯綠色（如放置后變?yōu)榫G色，可加溴0.2 mL，煮沸除去多涂的溴即可）。

29%碳酸鈉溶液：取29 g碳酸鈉溶于100 mL蒸餾水或10.8 g無水碳酸鈉溶于100 mL蒸餾水中即得。

對照品溶液：稱取沒食子酸對照品約5 mg精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

大三果供試品溶液：取大三果供試品300 mg，精密稱定，置250 mL平底燒瓶中，精密加入60%乙醇150 mL，稱重。50℃溫浸提取12 h，冷卻至室溫，60%乙醇補(bǔ)足原重量，濾過，作為供試品溶液。

大三果鞣質(zhì)部位供試品溶液：取鞣質(zhì)部位粉末約34 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶，60%乙醇溶解，定容，搖勻，備用。

表7 大三果藥材加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表8 大三果鞣質(zhì)部位加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

顯色方法：供試液2 mL置25 mL容量瓶中，加入1 mL磷鉬鎢酸試液，再加去離子水10 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30分鐘，以相應(yīng)的試劑為空白，在760 nm的波長處測定吸光度。

2.2.2 顯色穩(wěn)定性考察

精密吸取干酪素吸附前后溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.2.1”顯色，測定吸光度。每隔10 min測定一次，結(jié)果顯示，靜置顯色20 min后反應(yīng)充分，在20 min到180 min之內(nèi)穩(wěn)定，溶液吸附前后的吸光度RSD值分別為0.4%和0.25%

2.2.3 磷鉬鎢酸比色法測定波長的選擇

分別精密吸取沒食子酸對照品溶液和大三果樣品干酪素吸附前后溶液各2 mL，置25 mL棕色量瓶中，按“2.2.1”顯色，搖勻，暗處放置30 min，400-900 nm范圍內(nèi)掃描測定吸收光譜。顯色后全波長掃描圖，λMAX為760±2 nm。

2.2.4 干酪素用量考察

精密吸取供試品溶液25 mL，分別加入不同量干酪素0.4 g，0.6 g，0.8 g，1 g和1.2 g，每組平行2份，按供試品含量測定法測定含量，結(jié)果表明加入0.8 g干酪素測定鞣質(zhì)的含量較為穩(wěn)定，故選擇干酪素用量為0.8 g。

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取沒食子酸對照品溶液（0.0504 mg·mL-1）0.5、1、2、3、4、5 mL，置25 mL容量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1ml，再分別加水11.5 mL、11 mL、10 mL、9 mL、8 mL、7 mL，按“2.2.1”顯色，測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程：Y=116.53X+0.0309，r=0.9991，沒食子酸在1.008-10.08 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

2.2.6 精密度考察

精密吸取干酪素吸附前后溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，連續(xù)測定6次，RSD分別為0.12%，0.32%，該方法精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性考察

稱取大三果樣品300 mg 6份，精密稱定，“2.2.10”項(xiàng)方法制備供試品溶液，顯色測定吸光度，計(jì)算鞣質(zhì)成分的含量。RSD為0.51%，該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察

按2.2.1制備供試品溶液，分別于0，10 min，20 min，30 min，60 min，90 min，120 min精密吸取干酪素吸附前后溶液各2 mL，按“2.2.10”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算鞣質(zhì)類成分的含量。RSD為0.30%，樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)

大三果藥材加樣回收率試驗(yàn)：稱取6份大三果藥材粉末（過50目篩），各150 mg，精密稱定，分別精密加入沒食子酸對照品溶液6 mL（6 mg·mL-1），置250 mL平底燒瓶中，精密加入60%乙醇150 mL，稱重。50℃溫浸提取12 h，冷卻至室溫，用60%乙醇補(bǔ)足原重量，過濾過，取續(xù)濾液，按“2.2.10”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算鞣質(zhì)含量，計(jì)算平均加樣回收率為（表7）。

表9 大三果藥材和鞣質(zhì)部位鞣質(zhì)含量測定結(jié)果（n=3）

大三果鞣質(zhì)部位加樣回收率試驗(yàn)：稱取6份大三果鞣質(zhì)部位粉末約17 mg，精密稱定。分別精密加入1 mL沒食子酸對照溶液（9.35 mg·mL-1），置于50 mL容量瓶。60%乙醇溶解后，定容至刻度，按“2.2.10”項(xiàng)下方法測定鞣質(zhì)含量，計(jì)算加樣回收率（表8）。

2.2.10 總鞣質(zhì)含量測定

總酚測定：取3個(gè)批次大三果供試品300 mg，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液。取2 mL，移入25 mL容量瓶，照“2.2.1”顯色方法顯色，測定吸光度。

不被吸附的多酚精密量取供試品溶液25 mL，加至已盛有干酪素0.8 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液。精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，按“2.2.1方法顯色，測定吸光度。計(jì)算鞣質(zhì)含量，結(jié)果(表9)。

精密稱取3個(gè)批次大三果鞣質(zhì)部位粉末約34 mg置于50 mL容量瓶。60%乙醇溶解，定容，搖勻，作為測定不被吸附多酚的樣品溶液。按藥材鞣質(zhì)含量測定方法測定總酚和不被吸附多酚，測定吸光度，計(jì)算總鞣質(zhì)含量，結(jié)果（表9）。

3 討論

以各成分含量為指標(biāo)對供試品的制備方法（提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間等）進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示其在50%甲醇中可以完全溶解，樣品出峰佳。對不同廠家干酪素（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司、北京博奧拓達(dá)科技有限公司及北京索萊寶科技有限公司）空白干擾試驗(yàn)考察結(jié)果表明干酪素水浸出液中，含有干擾試驗(yàn)物質(zhì)；不同生產(chǎn)廠及批號(hào)的干酪素，干擾試驗(yàn)物質(zhì)含量有明顯差異。故“不被吸附多酚”測定中，應(yīng)采用同生產(chǎn)廠家、同批號(hào)的干酪素做空白試驗(yàn)。

本文主要觀察大三果藥材與其鞣質(zhì)部位中3種特征性成分及總鞣質(zhì)含量綜合評價(jià)大三果的質(zhì)量。方法穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可為大三果的質(zhì)量控制方法研究提供參考。