王瑤，謝敏杰

腦卒中已成為全球人口死亡和殘疾的主要原因，占據(jù)年死亡人數(shù)的10%[1]。缺血性腦卒中不僅涉及神經(jīng)元功能障礙，還包含許多細(xì)胞間復(fù)雜的相互作用，包括內(nèi)皮細(xì)胞、血腦屏障、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）和免疫系統(tǒng)[2]。卒中的發(fā)病過程是復(fù)雜且多階段的，其中，強烈炎癥反應(yīng)引發(fā)的繼發(fā)性進展尤為重要[3]。然而，腦卒中作為高致死性及高致殘性疾病，在治療方法上依然十分有限。近年來研究進展提示免疫反應(yīng)在其病程進展中起重要作用。急性腦缺血后的各種神經(jīng)免疫事件包括小膠質(zhì)細(xì)胞激活、白細(xì)胞浸潤入腦及促炎因子分泌等，此前淋巴細(xì)胞已被確定為驅(qū)動神經(jīng)炎癥反應(yīng)和導(dǎo)致卒中結(jié)果的關(guān)鍵白細(xì)胞亞群[4]。相對于其他淋巴細(xì)胞亞群的促炎作用，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞Treg具有免疫抑制功能，主要參與維持免疫穩(wěn)態(tài)，并且已經(jīng)在幾種炎性疾病中被表征為疾病限制性保護性細(xì)胞，特別是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的原發(fā)性炎性疾病中[4]。本文將對有關(guān)腦卒中的免疫反應(yīng)及Treg在其中的作用的研究進行綜述。

1 Treg

目前研究最多的Treg亞群是CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞亞群。幾乎所有抑制性Treg亞群都表達Foxp3，后者是與其免疫抑制功能直接相關(guān)的通用轉(zhuǎn)錄因子，正向調(diào)控Treg細(xì)胞[4]。盡管Treg可能在機體穩(wěn)態(tài)下對CNS的保護并非十分重要，但一旦耐受被破壞，則需要Treg在CNS中重建體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[5]。除了維持自身耐受，Treg還可以抑制多種免疫反應(yīng)。因此，Treg在腦卒中后繼發(fā)性炎癥中具有重要的調(diào)節(jié)作用。腦中Treg細(xì)胞有活化/記憶表型，并且許多Treg細(xì)胞特征基因的表達水平高于外周Treg細(xì)胞[6]。Treg在體內(nèi)可通過多種機制發(fā)揮免疫抑制作用，包括接觸抑制及細(xì)胞因子介導(dǎo)的抑制作用。前者與細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、CD73-CD39、顆粒酶、CD95-CD95配體等有關(guān)；介導(dǎo)免疫抑制的細(xì)胞因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)、白介素-10（interleukin-10 IL-10）等[7]。其中，IL-10在腦卒中后神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)過程中具有重要作用。研究表明，淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10增加時，腦卒中預(yù)后有所改善[8]。Tregs可與多種外周炎性細(xì)胞相互作用，包括①抑制中性粒細(xì)胞活性、誘導(dǎo)凋亡或死亡及調(diào)節(jié)其滲入損傷部位；②調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化、活性與存活；③減少T細(xì)胞滲入損傷組織與活性[9]。越來越多的研究表明，Treg在腦卒中中起保護作用[10-13]。Treg的功能及相關(guān)機制依賴于不同的組織及環(huán)境，下面將重點描述Treg在腦卒中中的作用及可能機制。

2 腦卒中的免疫反應(yīng)

在腦卒中后，CNS和外周免疫系統(tǒng)均發(fā)生多種免疫級聯(lián)反應(yīng)，包含固有免疫和獲得性免疫[14,15]。其中固有免疫的激活途徑包含補體激活途徑（通過識別損傷細(xì)胞或招募的細(xì)胞表達的損傷相關(guān)分子模式分子（damage-associated molecular pattern molecules，DAMPs）激活和血小板介導(dǎo)的激活途徑[16]。

2.1 中樞免疫系統(tǒng)

腦卒中發(fā)生后，CNS中的固有免疫細(xì)胞通過清除細(xì)胞碎片和中和神經(jīng)毒素來限制腦損傷。然而，隨后適應(yīng)性免疫應(yīng)答的擴增推動了缺血性腦損傷的進展[17]。在CNS中，廣泛的壞死細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)和DAMPs，如核酸、核苷酸、高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)等，激活多種細(xì)胞，增強循環(huán)免疫細(xì)胞的趨化性[14]。腦內(nèi)的常駐免疫細(xì)胞--小膠質(zhì)細(xì)胞活化是大腦炎癥反應(yīng)的第一步，隨后是內(nèi)皮細(xì)胞的免疫應(yīng)答，繼而發(fā)生中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤[18]。小膠質(zhì)細(xì)胞通過模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）識別體內(nèi)的DAMPs而活化[19]?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞具有雙重作用，一方面在腦卒中后迅速遷移至損傷部位，產(chǎn)生大量炎性因子和細(xì)胞毒性物質(zhì)，加速組織損傷；另一方面也可通過吞噬碎片、產(chǎn)生抗炎因子和生長因子來促進組織修復(fù)和組織重塑[20]。缺氧環(huán)境發(fā)生在腦卒中早期，是小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化的主要原因，而兩者對缺氧環(huán)境的反應(yīng)并不一致。前者可發(fā)生低氧誘導(dǎo)因子-1 α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）依賴性自噬性細(xì)胞死亡，伴隨著促炎細(xì)胞因子IL-8和腫瘤壞死因子-α 66（Tumor Necrosis Factor，TNF-α66）的釋放；后者則轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧代謝以適應(yīng)低氧環(huán)境[21,22]。此外，在CNS缺血后，星形膠質(zhì)細(xì)胞也經(jīng)歷了多種變化，包括快速腫脹、Ca2+信號傳導(dǎo)增強和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達增加，隨后形成膠質(zhì)瘢痕，在缺血區(qū)和健康組織間形成界限[16,23]。星形膠質(zhì)細(xì)胞還通過產(chǎn)生炎癥介質(zhì)（IL-6，IL-1β）、補體成分和趨化因子[CXCL12，CXCL1，CXCL10和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）]以維持CNS缺血后的免疫應(yīng)答[16]。其中CXCL12還可能參與了神經(jīng)干/祖細(xì)胞向病變部位的遷移[24]，有助于組織修復(fù)。

2.2 外周免疫系統(tǒng)

除了CNS的固有細(xì)胞，外周循環(huán)免疫細(xì)胞也可穿過血腦屏障（blood brain barrier，BBB）參與CNS內(nèi)炎癥反應(yīng)。這一過程可能主要發(fā)生在毛細(xì)血管后小靜脈。浸潤的效應(yīng)細(xì)胞可以穿過內(nèi)皮細(xì)胞膜并進入血管旁空間，然后穿過膠質(zhì)細(xì)胞界限進入實質(zhì)[25]。包括固有免疫和獲得性免疫在內(nèi)的外周免疫系統(tǒng)，通過釋放活性氧、活性氮及外肽酶等神經(jīng)毒性因子，促進繼發(fā)性神經(jīng)變性，在卒中的病理生理學(xué)中起重要作用[26]。

在卒中早期，BBB被破壞，伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞的粘附分子表達增強，同時分泌促炎介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、中性粒細(xì)胞趨化因子和前列腺素。缺血缺氧條件下，活性氧代謝物導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、分離，這些最終引發(fā)外周免疫細(xì)胞滲入腦實質(zhì)[1,16]。

CNS缺血性損傷的標(biāo)志之一就是中性粒細(xì)胞的早期滲入。在CNS損傷時，中性粒細(xì)胞首先通過其受體CXCR2從骨髓募集到血液中。然后在血液中通過與趨化因子（如CXCL1和CXCL2/3）相互作用，被進一步募集到腦組織中。此后中性粒細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)、釋放溶解酶、觸發(fā)腦毛細(xì)血管淤積，促進CNS損傷。另外，中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)（neutrophil extracellular traps，NETs）也可能惡化腦卒中，成為中性粒細(xì)胞的又一損傷機制[16]。

腦卒中后期發(fā)生淋巴細(xì)胞浸潤，進一步影響腦卒中預(yù)后。淋巴細(xì)胞敲除對小鼠卒中具有保護作用。已有研究指出，這種保護作用主要由于缺乏T細(xì)胞應(yīng)答[16]。CD4+T細(xì)胞可能通過分泌干擾素-γ（Interferon，INF-γ）和IL-21等炎性細(xì)胞因子而產(chǎn)生有害作用，CD8+T細(xì)胞則通過穿孔素-顆粒酶途徑導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[16,27]。另外，此前已有研究顯示，γδT淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17在缺血再灌注腦損傷晚期有重要作用[28]。另一項研究指出，在小鼠模型中，活化的B淋巴細(xì)胞在卒中后數(shù)周內(nèi)滲入梗塞組織，使用抗CD20抗體消除B細(xì)胞可防止出現(xiàn)延遲性認(rèn)知缺陷[29]。

另一方面，越來越多研究顯示，缺血性腦損傷可引起外周免疫抑制。大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）96 h后的結(jié)果顯示，腦卒中導(dǎo)致脾萎縮，最終T細(xì)胞增殖反應(yīng)和炎性細(xì)胞因子的分泌減少，引發(fā)了顯著的免疫抑制。這些變化導(dǎo)致脾臟和血液中B細(xì)胞數(shù)量的急劇減少，而CD4+FoxP3+Treg細(xì)胞增加[30]。與之相反的另一項研究發(fā)現(xiàn)，MCAO 1d后，小鼠外周CD4+CD25+Foxp3+Tregs數(shù)目下降[10]。

至今為止，腦卒中的治療依然十分有限，組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）仍是唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)的卒中溶栓治療藥物[26,31]，且必須在癥狀開始的4.5 h內(nèi)使用才能獲得臨床療效[32]。由于卒中后幾小時出血風(fēng)險增加，實際上只有約1%～2%的卒中患者可以從rtPA中獲益[24]?？紤]到炎癥反應(yīng)在腦卒中進展中的重要作用，免疫調(diào)節(jié)治療已成為一種有前景的治療方法。

3 Treg在腦卒中后的作用及相關(guān)機制

研究表明，Tregs在腦卒中后3～5 d才進入腦實質(zhì)，在不滲入腦實質(zhì)或抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的情況下，Tregs可通過保護BBB發(fā)揮其早期神經(jīng)保護作用[15,33]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein，MMP-9）是促進BBB損壞的關(guān)鍵分子。體內(nèi)和體外研究均顯示，Tregs可抑制外周中性粒細(xì)胞源性MMP-9的產(chǎn)生，從而防止BBB的蛋白水解損傷[10,15]。此過程依賴于Treg與中性粒細(xì)胞直接接觸，程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-Ligand 1，PD-L1）介導(dǎo)的信號通路在其中具有重要作用[34]。有研究進一步表明，在缺血性腦卒中后，體內(nèi)過繼轉(zhuǎn)移Tregs完全消除了卒中后tPA誘導(dǎo)的MMP9和CC趨化因子配體2（CC chemokine ligand2，CCL2）升高，從而保護BBB的完整性，對tPA治療后的腦卒中具有保護作用。其中CCL2-CC趨化因子受體2（CCR2）軸在腦缺血中具有多種作用，包括BBB破壞和外周白細(xì)胞的募集[35]。

Treg在缺血性卒中后期的保護作用常常與T細(xì)胞侵襲減少[15]、抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、減少小膠質(zhì)細(xì)胞/單核細(xì)胞活化或促進小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞向M2型分化有關(guān)[33]。將腦中Treg與T細(xì)胞共培養(yǎng)，Treg有效抑制了T細(xì)胞的增殖及IFN-γ和 TNF-α的產(chǎn)生[6]。在腦出血模型中，Tregs可以通過IL-10/糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）/PTEN軸促進小膠/巨噬細(xì)胞極化為M2型，從而對卒中發(fā)揮保護作用[36]。此外，活化的Tregs可通過IL-10促進正常和腦缺血小鼠腦室下區(qū)（Subventricular zone，SVZ）中神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）增殖，為缺血性腦卒中提供了一種新的治療方法[37]。除了在免疫調(diào)控中的作用，越來越多的研究證明Treg在多種組織中具有促進組織再生的作用。在腦組織中，Treg可通過CCN3促進少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和髓鞘形成，促進髓鞘再生[38]，有利于腦白質(zhì)損傷恢復(fù)。

雖然大量研究證明了Treg在腦卒中后的保護作用，Treg依然可能促進腦損傷。Kleinschnitz C等[39]首次證明了Tregs具有促進急性缺血性腦卒中損傷的作用，并指出Tregs通過淋巴細(xì)胞功 能 相 關(guān) 抗 原 -1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）/細(xì) 胞 間 黏 附 分 子 -1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）途徑與活化的內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，同時通過與血小板相互作用，誘導(dǎo)體內(nèi)微血管功能障礙。與之一致的觀點認(rèn)為，Treg的非免疫學(xué)功能可能參與內(nèi)皮損傷、血管炎癥和微血栓形成[4]。

類似于Treg在腦中的作用，腦卒中后Treg對外周免疫也具有雙重作用。有研究表明，Treg的過繼轉(zhuǎn)移減少了卒中早期的全身炎癥反應(yīng)。另一方面，Treg過繼轉(zhuǎn)移改善了腦損傷后亞急性期的免疫抑制程度（如淋巴細(xì)胞減少）[4]。因此，Tregs在腦卒中后不同時間段對CNS和外周免疫的影響需要進一步探索，外周免疫對CNS炎癥的影響也需要更系統(tǒng)地研究。

隨著對Tregs在腦卒中中作用的重視，Tregs如何進入腦組織也引起了人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，卒中后IL-33促進Treg募集到受損組織中，有利于CNS損傷后的恢復(fù)[9]。另一項研究表明，CXC趨化因子配體14（CXCL14）在腦卒中Treg的活化中具有重要作用。CXCL14通過上調(diào)細(xì)胞朊蛋白（PrP C）、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1和MMPs以促進外周循環(huán)的未成熟的樹突狀細(xì)胞（immature dendritic cell，iDC）向缺血組織粘附、遷移和歸巢。Treg在腦缺血區(qū)域的積累由CXCL14和iDC分泌的IL-2共同介導(dǎo)，且CXCL14在很大程度上促進了IL-2誘導(dǎo)的Treg分化[13]。

4 結(jié)論及未來方向

關(guān)于Treg在腦卒中后作用的研究之間仍然存在爭議。不同實驗?zāi)Ｐ图芭R床卒中亞型之間的差異都可能對Treg功能具有直接影響。這些差異包括繼發(fā)性微血栓是否形成、誘導(dǎo)的外周免疫改變以及局部神經(jīng)炎癥的程度。因此Treg消耗和擴增都可能對卒中結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響[4]。另外，當(dāng)前主要使用Foxp3-白喉毒素受體（diphtheria toxin receptor，DTR）小鼠模型來研究Treg在組織再生過程中的作用，而使用這種模型存在一個問題，即當(dāng)Treg長期耗竭時，小鼠會發(fā)生自發(fā)的自身免疫性疾病[9]。因此，我們需要更多、更創(chuàng)新的研究。鑒于Treg的組織特異性，研究CNS中Treg的作用時，可以借鑒Treg在其他組織中的作用及機制。例如，在非淋巴組織中，活化的FOXP3+Treg細(xì)胞對IL-33具有高度敏感性,我們可以進一步研究IL-33如何在炎性CNS中特異性地影響Tregs的功能[5]。最近一項十分有趣的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物生態(tài)失調(diào)可引起調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增加和IL-17+γδT細(xì)胞的減少，抑制卒中后效應(yīng)T細(xì)胞從腸道到腦膜的運輸，進而影響CNS缺血性損傷的反應(yīng)，首次提出腸-腦軸在缺血性腦卒中中的作用[26]。腦卒中是多細(xì)胞參與、多階段的損傷過程，炎癥反應(yīng)及免疫系統(tǒng)在其中發(fā)揮著復(fù)雜而又重要的作用，因此依然需要更多的研究來確定不同炎癥細(xì)胞在不同階段對腦卒中的影響，尤其是Treg在其中的作用，以推動其在臨床腦卒中中的應(yīng)用，為腦卒中提供新的治療方案。