戢敏，陳星，喻雪琴，陳芳，梅怡晗，梅小平

(1川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充 637000；2首都醫(yī)科大學(xué))

肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其涉及到的致病因素包括各種肝炎病毒、藥物、乙醇等，疾病到后期可進(jìn)展為肝硬化、肝癌，對(duì)人類(lèi)健康影響較大。肝組織活檢是某些肝臟疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其臨床應(yīng)用有一定的局限性。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，外泌體及外泌體源性微小RNA(miRNAs)是由多種細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的一種雙層囊泡小體(外泌體)及物質(zhì)，起初外泌體被認(rèn)為是一種人體內(nèi)的代謝廢物，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)外泌體具有豐富的作用，如細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)等。近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體及其外泌體源性miRNAs參與了肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展，是肝臟疾病診治的潛在生物標(biāo)志物，這為臨床上早期診斷與治療肝臟疾病提供了新思路?，F(xiàn)就外泌體源性miRNAs在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行綜述。

1 外泌體源性miRNAs的生物學(xué)特征

外泌體是在1987年由Johnston等[1]在哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，其直徑為30～100 nm,密度為1.10～1.20 g/mL，可由B淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞釋放[2]，其在外周血、尿液、唾液、羊水及腹水等體液中均可檢出[3,4]。外泌體可攜帶蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子受體、mRNA和miRNAs等多種生物活性物質(zhì)，并可在體液中穩(wěn)定表達(dá)與循環(huán)，具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)“載體”，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳導(dǎo)作用，并且在機(jī)體的正常生理及病理過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如抗原提呈、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與遷徙、促進(jìn)組織損傷后的愈合、靶細(xì)胞的活化、增殖、分化與凋亡、病毒的復(fù)制與抑制等[5]。Valadi等[6]在2007年研究發(fā)現(xiàn)：機(jī)體外泌體是由肥大細(xì)胞分泌產(chǎn)生的，可將miRNAs、mRNA以及mRNA翻譯產(chǎn)生機(jī)體生理與病理狀態(tài)所需要的蛋白質(zhì)，及信號(hào)物質(zhì)傳遞到靶細(xì)胞，從而初步認(rèn)為，外泌體具有在細(xì)胞間選擇性地輸送RNA分子的功能，但其作用機(jī)制尚不清楚。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，體液特別是外周血中的外泌體是miRNAs的主要來(lái)源，對(duì)miRNAs起保護(hù)作用，阻止其不受RNA酶的降解，使其能在體液中長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)并被穩(wěn)定地檢出。有研究顯示，不同肝臟疾病的多類(lèi)型細(xì)胞都能分泌受外泌體產(chǎn)生與保護(hù)的miRNAs，在相應(yīng)肝臟疾病細(xì)胞中miRNAs表達(dá)水平發(fā)生變化時(shí)，其受外泌體影響與保護(hù)的miRNAs也會(huì)出現(xiàn)同步變化，其miRNAs表達(dá)水平變化幅度比外泌體更大，這種現(xiàn)象稱(chēng)為“miRNAs放大效應(yīng)或海綿效應(yīng)”。miRNAs是一段長(zhǎng)度為19～23 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈分子，可與Ago2形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，以完全配對(duì)或不完全配對(duì)方式與mRNA的3′端非編碼區(qū)結(jié)合發(fā)揮降解或沉默靶細(xì)胞中mRNA的表達(dá)。血清、血漿、尿液、乳汁等體液中存在著大量的miRNAs,其循環(huán)體液中miRNAs譜的異常表達(dá)與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]，并且體液中的miRNAs能作為某些疾病診斷的新型標(biāo)志物與治療靶標(biāo)[9]。

2 外泌體源性miRNAs在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用

2.1 外泌體源性miRNAs在脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用 肝細(xì)胞通過(guò)外泌體可誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)水平發(fā)生變化,從而發(fā)揮機(jī)體免疫誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而調(diào)控肝組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展。在我國(guó)，脂肪肝多分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝(NAFLD)。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，酒精性脂肪肝小鼠外周血中外泌體高表達(dá)，采用miRNA芯片研究也顯示，酒精性脂肪肝小鼠的外周血及肝組織中miRNAs高表達(dá)。Saha等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇可以誘導(dǎo)人單核細(xì)胞釋放富含miRNA-27a的外泌體，而外泌體可刺激原始單核細(xì)胞的極化或提高其活性，使原始單核細(xì)胞分化為M2巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)炎性因子分泌與高表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。另一項(xiàng)研究[12]顯示，乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞分泌的外泌體，其釋放與激活半胱天冬酶3依賴(lài)的通路有關(guān)，而該外泌體中含有的CD40配體能夠促使巨噬細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)和促進(jìn)酒精性肝病的炎性反應(yīng)。NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者分泌的外泌體，主要是由自然殺傷T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。NAFLD小鼠模型囊泡中miRNAs表達(dá)明顯增加，表達(dá)模式多樣化[13]。研究結(jié)果顯示，病理狀態(tài)下的細(xì)胞能誘導(dǎo)獨(dú)特物質(zhì)囊泡水平高表達(dá)，從而誘導(dǎo)疾病的病理生理變化過(guò)程。脂質(zhì)高水平表達(dá)可誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞囊泡的釋放，并活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而引發(fā)NASH[14]。此外，膽堿缺乏L-氨基酸(CDAA)喂養(yǎng)小鼠分泌的外泌體中miR-122、miR-192高表達(dá)。在NAFLD進(jìn)展期間，囊泡中的miRNAs隨時(shí)間推移表達(dá)逐漸增高，而在肝臟中逐漸呈現(xiàn)低表達(dá)。這些研究表明，miRNAs在肝臟病理生理學(xué)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，miRNAs在肝臟疾病中的表達(dá)水平差異和模式是不相同的，其發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.2 外泌體源性miRNAs在慢性肝炎發(fā)生發(fā)展中的作用 外泌體源性miRNAs在慢性肝炎的發(fā)生發(fā)展中起到了雙刃劍的作用。一方面，外泌體源性miRNAs能影響機(jī)體的免疫反應(yīng)，HBV感染肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞后，誘導(dǎo)肝細(xì)胞的正常生理病態(tài)化，外泌體源性miRNAs包裹的蛋白質(zhì)參與了肝細(xì)胞的正常代謝調(diào)節(jié)；同時(shí)，HBV感染肝細(xì)胞后誘導(dǎo)分泌的外泌體源性miRNAs具有致病信號(hào)的傳遞作用，外泌體源性miRNAs可能參與病毒間或病毒與靶細(xì)胞間相關(guān)信息的傳遞作用以及疾病的發(fā)生發(fā)展與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程[15]，從而使外泌體源性miRNAs成為HBV等病毒傳播的路徑[2]。Kouwaki等[16]研究發(fā)現(xiàn)，感染HBV的肝細(xì)胞能釋放含有HBV核酸的外泌體源性miRNAs，能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞高表達(dá)與NK細(xì)胞及配體的激活作用，在NK細(xì)胞激活后，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體在病毒感染初期誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ并高表達(dá)，以促進(jìn)肝細(xì)胞核中HBV核酸的降解與清除，達(dá)到抗病毒作用。然而有研究[17]顯示，慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中含HBV的外泌體源性miRNAs起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，這種外泌體源性miRNAs能誘導(dǎo)和促進(jìn)NK細(xì)胞水平下降與功能受損，導(dǎo)致IFN-γ水平下降；對(duì)NK細(xì)胞的增殖和存活發(fā)揮抑制作用，是HBV逃逸宿主固有免疫的主要發(fā)生機(jī)制。通過(guò)對(duì)20例CHB患者外周血外泌體源性miRNAs研究比較發(fā)現(xiàn)，其外泌體源性miRNAs表達(dá)水平上調(diào)的有：miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224，下調(diào)的有：miR-101、miR-106b、miR-122、miR-195，但也有外泌體源性miRNAs表達(dá)無(wú)顯著性變化的[18]，如miR-21等。還有研究顯示，HCV感染肝細(xì)胞后分泌的外泌體源性miRNAs包裹病毒RNA，而這些外泌體源性miRNAs可進(jìn)一步感染新的肝細(xì)胞，提示外泌體源性miRNAs在HCV感染擴(kuò)散過(guò)程中也具有非常重要的再感染作用[19]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體源性miRNAs中包含有miR-19a，其可直接激活肝星狀細(xì)胞(HSC)的STAT3-TGF-β信號(hào)通路，誘導(dǎo)和促進(jìn)肝組織纖維化的發(fā)生發(fā)展[20]。

2.3 外泌體源性miRNAs在肝纖維化及肝硬化發(fā)生發(fā)展中的作用 肝纖維化是各種因素導(dǎo)致肝細(xì)胞間細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉積的一種病理狀態(tài)，它與HSC活化、增殖、分化與凋亡密切相關(guān)。外泌體源性miRNAs能調(diào)節(jié)HSC的活化、增殖、分化、凋亡及遷移，誘導(dǎo)活化的HSC數(shù)量與功能增加，這在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用。Seo等[21]研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞損傷后可以分泌含有Toll樣受體3配體的外泌體源性miRNAs，激活HSC的Toll樣受體3，誘導(dǎo)和促進(jìn)γδ T淋巴細(xì)胞分泌大量的IL-17A，高表達(dá)的IL-17A能誘導(dǎo)和促進(jìn)肝纖維化的形成。Charrier等[22]研究發(fā)現(xiàn)，激活后的HSC能分泌含有結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)2的外泌體源性miRNAs，并在HSC之間發(fā)揮信號(hào)通路的傳遞作用。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是HSC活化的標(biāo)志蛋白，外泌體源性miRNAs能促進(jìn)α-SMA和膠原纖維的高表達(dá)，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生與形成。外泌體源性miRNAs除了能調(diào)節(jié)HSC活化外，還與HSC遷移關(guān)系密切。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四氯化碳誘導(dǎo)建立形成的肝纖維化或肝硬化小鼠，外周血中外泌體源性miRNAs高表達(dá)，可促進(jìn)HSC活化、增殖與ESM的形成；這可能與外泌體中的鞘氨醇激酶1/鞘氨醇-1-磷酸酯在HSC的活化、增殖與ESM的形成及遷移過(guò)程中所發(fā)揮的關(guān)鍵性作用相關(guān)[23]。在肝纖維化與肝硬化患者中，竇內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少與功能失衡將會(huì)導(dǎo)致門(mén)脈高壓。研究發(fā)現(xiàn)，HSC能夠釋放含有Hedgehog配體的外泌體源性miRNAs到竇內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)竇內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量與功能失調(diào)，初步認(rèn)為外泌體源性miRNAs可誘導(dǎo)和促進(jìn)肝纖維化與肝硬化所致的門(mén)脈高壓的發(fā)生。另外，也有研究顯示，來(lái)源于原發(fā)性膽汁性肝硬化外周血中的外泌體源性miRNAs能選擇性地誘導(dǎo)不同亞群抗原遞呈細(xì)胞共刺激分子的高表達(dá)[24]，這也可能是導(dǎo)致肝硬化及門(mén)脈高壓發(fā)生的又一原因。外泌體源性miRNAs中的miR-214表達(dá)下調(diào)明顯，推測(cè)miR-214可能是一種潛在的診斷肝組織纖維化的標(biāo)志物之一，但miR-214在肝組織發(fā)生纖維化中表達(dá)下調(diào)機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究[25]。

2.4 外泌體源性miRNAs在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用 Sohn等[26]研究發(fā)現(xiàn)，與肝硬化患者比較，原發(fā)性肝癌(HCC)患者外周血中外泌體源性miRNAs表達(dá)升高明顯，其中高表達(dá)的有：miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224，低表達(dá)的有：miR-101、miR-106b、miR-12和miR-195。有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中miRNA-10b的表達(dá)與預(yù)后呈正相關(guān)，同時(shí)miRNA-10b、miRNA-200A和miRNA-122與肝硬化的形成關(guān)系密切，具有調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與ECM形成的作用，進(jìn)而誘導(dǎo)和促進(jìn)了肝硬化的發(fā)生與發(fā)展；認(rèn)為miRNA-10b、miRNA-200A和miRNA-122的表達(dá)高低可作為診斷肝硬化相關(guān)肝癌的標(biāo)志物之一[27]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在肝纖維化、肝硬化、肝癌等疾病中是一種具有疾病鑒別診斷意義較高的外泌體生物標(biāo)志物，具有與miR-122作用相反的功能。miR-122是在肝組織中豐度表達(dá)最高的miRNA,參與了肝臟組織的脂質(zhì)代謝過(guò)程[28]，miR-122在部分肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與肝癌患者預(yù)后、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[29]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在肝癌的發(fā)生中具有重要的調(diào)控作用，在肝癌患者腫瘤組織內(nèi)異常高表達(dá)，且miR-21高表達(dá)預(yù)示肝癌患者的生存期更短[30,31]。有研究比較了30例HCC患者與30例慢性HBV感染患者的外周血miR-21表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)HCC患者外周血中miR-21表達(dá)異常增高；另外一項(xiàng)研究比較了20例肝癌患者和20例CHB患者的外泌體源性miRNAs發(fā)現(xiàn)：盡管在肝癌及CHB患者外周血中miR-21的表達(dá)沒(méi)有顯著性差異，但肝癌患者miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224表達(dá)較CHB患者明顯上調(diào)，而miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195表達(dá)明顯下調(diào)[23]。這些研究表明，外泌體源性miRNAs在肝臟疾病中表現(xiàn)多樣和不穩(wěn)定，有待進(jìn)一步研究表達(dá)水平穩(wěn)定并具有特異性的外泌體源性miRNAs來(lái)作為HCC等肝臟疾病的標(biāo)志物。

目前，肝組織活檢仍然是診斷肝臟疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，而對(duì)外泌體及其內(nèi)容物的研究，為肝臟相關(guān)疾病提供了無(wú)創(chuàng)檢查的可能，有希望應(yīng)用于肝臟疾病的早期診斷以及藥物療效的檢測(cè)。此外，外泌體源性miRNAs靶向細(xì)胞作用機(jī)制尚不明確，因此外泌體源性miRNAs所介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)通路激活與抑制仍是今后研究的方向之一。