孟燕,喬杰

(北京大學(xué)第三醫(yī)院 ，北京100083)

衰老是人類生活中自然而漸進的過程，主要表現(xiàn)為組織功能的逐漸減退，它受遺傳、環(huán)境、生活方式、疾病等多種因素的影響。機體衰老是細胞衰老的結(jié)果,而細胞衰老是DNA維持、修復(fù)、控制過程異常的結(jié)果。DNA甲基化是衰老過程中研究最深入的表觀遺傳修飾之一。近年來，隨DNA甲基化檢測技術(shù)特別是全基因組定量法的普及，DNA甲基化形成、DNA去甲基化以及DNA甲基化的作用機制等已逐漸明確。DNA甲基化與年齡的關(guān)系通常被歸類為“表觀遺傳漂變”現(xiàn)象，其特征是基因組的逐漸廣泛去甲基化和基因特異啟動子相關(guān)的CpG島(CGIs)的超甲基化[1]。表觀遺傳修飾是指基因堿基序列不發(fā)生改變，但基因表達發(fā)生了可遺傳性改變的調(diào)控方式[2]。表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控及染色體空間結(jié)構(gòu)調(diào)控等。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)、最重要的基因表觀修飾方式之一，動物組織DNA甲基化主要發(fā)生在CpG位點上。Cp甲基化是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNA methyltransferases，Dnmts)將甲基基團轉(zhuǎn)移到 DNA 胞嘧啶殘基上的過程[3]。DNA甲基化在調(diào)控基因表達、染色體結(jié)構(gòu)維持、X染色體失活和基因組印跡中起重要作用[4]?，F(xiàn)將DNA甲基化的生物學(xué)特征，及其在胚胎、生殖細胞發(fā)育和與衰老相關(guān)的模式的研究進展綜述如下。

1 DNA甲基化的生物學(xué)特征

1.1 DNMTs DNMTs是保守的催化序列，在DNA甲基化中起著關(guān)鍵性的作用。它催化甲基產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶，然后添加在DNA的CG二核苷酸的胞嘧啶上。哺乳動物組織中有四種DNMTs：DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L。DNMT1 作用于僅有一條甲基化鏈的DNA雙鏈，催化甲基轉(zhuǎn)移到新合成的DNA鏈上, 使其完全甲基化，此現(xiàn)象稱為維持甲基化; 而 DNMT3A和DNMT3B則催化新的甲基化位點發(fā)生反應(yīng), 稱為從頭甲基化。通過DNMTs的催化, DNA 甲基化才得以完成。

Yin 等[5]研究發(fā)現(xiàn)， DNMT1 、 DNMT3A在人類絨毛和蛻膜組織中表達, 當胚胎中DNA維持甲基化受到抑制時, 胚胎著床率降低, 胎兒流產(chǎn)的風險增加。這說明胚胎的著床與發(fā)育異?？赡芘c胚胎中 DNA 維持甲基化缺陷有關(guān)。 晁遠等[6]研究結(jié)果顯示, DNMT1、DNMT3A mRNA在自然流產(chǎn)絨毛組織中的表達量明顯低于人工流產(chǎn)絨毛組, 且二組DNMT3B mRNA的表達量間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明DNMT1、DNMT3A mRNA表達下調(diào)可能是造成絨毛中DNA甲基化不足的原因。DNMT1、DNMT3A 表達降低可能是自然流產(chǎn)的一種獨立誘發(fā)因素。

1.2 CpG島 DNA中的5-甲基胞嘧啶(5 mC)被稱之為人類DNA的第5種堿基，約占基因組堿基的1%。哺乳動物中CpG以兩種形式存在：一種分散于DNA序列中；另一種呈現(xiàn)高度聚集狀態(tài)，稱之為CpG島(CGIs)。CGIs指大于500個堿基對，且GC二核苷酸占50%以上DNA序列，60% CpG島位于基因啟動子區(qū)域， 其內(nèi)的CpG通常是非甲基化的，從而允許相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[7]。而大部分分散的CpG是甲基化的。相反，位于基因體的甲基化CpG二核苷酸不影響基因轉(zhuǎn)錄，但是可能會阻礙啟動子的激活[8]。余下40%的CGIs位于基因間和基因內(nèi)區(qū)域，因與啟動子無關(guān)而被定義為“孤兒CGIs”[9]。離啟動子CGIs至少2 kb處的CpGs密度較低(CGI約1/10)，被定義為CGI海岸，它們也參與基因表達的調(diào)控。CGI海岸經(jīng)常與組織特異性差異甲基化區(qū)域(DMRS)在正常組織中重疊[10]。

1.3 DNA去甲級化 DNA去甲基化包括主動去甲基化和被動去甲基化。

被動去甲基化是細胞通過抑制DNMT1表達來阻斷DNA甲基化維持，在細胞分裂過程中稀釋基因組中甲基化胞嘧啶的濃度，實現(xiàn)被動去甲基化。據(jù)報道[11]這種被動去甲基化機制是小鼠胚胎發(fā)育過程中原始生殖細胞去除基因組親本DNA甲基化的關(guān)鍵機制。[4]主動去甲基化是通過生物酶改變胞嘧啶上的甲基化修飾，可直接去除胞嘧啶上的甲基化，也可對甲基化進行修飾而導(dǎo)致胞嘧啶的改變。參與這一系列反應(yīng)的是一組酶—TET蛋白。TET蛋白家族有三個成員，分別是TET1、TET2、TET3。TET蛋白可以將5 mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5 hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)等一系列修飾形式。而胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)觸發(fā)堿基修復(fù)(BER)過程，將5fC和5caC修復(fù)為未甲基化胞嘧啶。AID/APOBEC(活化誘導(dǎo)脫氨酶/載脂蛋白B編輯復(fù)合物)酶可能涉及5 mC和5 hmC脫氨過程中，將5 mC和5 hmC脫氨基形成胸腺嘧啶和5-羥甲基尿嘧啶(5hmU)，然后通過BER/TDG活性從DNA中除去[12]。然而，大量的研究發(fā)現(xiàn)，5 hmC不僅僅是去甲基化的中間產(chǎn)物，它可以作為穩(wěn)定的表觀遺傳信號，因此，和 5 mC類似， 5 hmC 被認為是DNA的額外堿基[13]。然而， 5 hmC 水平在不同類型的細胞和組織中差異很大，含量最高的為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)[14]。在大腦中， 5 hmC在轉(zhuǎn)錄起始位點和主動轉(zhuǎn)錄基因的基因體上富集。更特異的是， 5 hmC 位于基因外顯子-內(nèi)含子交界處。另外，5 hmC 也位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的側(cè)翼區(qū)域，如增強子/沉默子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。類似的模式發(fā)生在CGIs上，其中5 hmC位于它們的邊界。但是，在重復(fù)序列中(例如SINE、LINE、LTR和衛(wèi)星DNA)5 hmC的含量是低的[13]。5 hmC 作用機制尚不完全清楚，但是有研究顯示 5 hmC 的定位受DNA序列和染色體表觀遺傳蛋白因子的影響[15]，從而推測該表觀遺傳信號影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能是合理的。例如，大腦中5 hmC由是MeCP2識別和結(jié)合，與轉(zhuǎn)錄功能有關(guān)[16]。關(guān)于5fC和5caC，由于它們在哺乳動物基因組中及其稀少，從而限制了我們對它們功能的認識。但是，一些研究[17]表明，這些去甲基化中間產(chǎn)物在哺乳動物基因組中是穩(wěn)定的，這為我們進一步研究其去甲基化之外的功能創(chuàng)造了條件。

2 DNA甲基化在胚胎、生殖細胞發(fā)育及衰老中的變化

DNA甲基化的變化從受孕開始，發(fā)生在整個生命過程。人類早期胚胎發(fā)育過程中，經(jīng)歷兩次大規(guī)模的DNA甲基化重編程，即整體范圍的去甲基化和重新甲基化，分別發(fā)生在早期胚胎發(fā)育階段和配子形成階段。環(huán)境、生活方式、營養(yǎng)等會影響DNA甲基化的模式。大多數(shù)組織的平均DNA甲基化水平在生命早期增加，隨著年齡的增長而逐漸降低。

2.1 DNA甲基化在胚胎發(fā)育、生殖細胞發(fā)育過程中的變化 小鼠的早期胚胎發(fā)育過程中經(jīng)歷了整體范圍的去甲基化和重新甲基化過程．小鼠精子的平均甲基化水平約為 80%，卵細胞約為 50%，在受精后3.5 天左右的內(nèi)細胞團(ICM) 時期， 甲基化水平降至最低，約為20%。胚胎從ICM 發(fā)育到 7.5 天左右，發(fā)生了整體范圍的重新甲基化，平均甲基化水平達到 73%[18]。近期在人早期胚胎發(fā)育的研究[19]中發(fā)現(xiàn)，人類與小鼠及其他哺乳動物的早期胚胎 DNA 甲基化動態(tài)非常相似。大體遵循著生殖細胞高甲基化、胚胎低甲基化；合子中親本的甲基化信息被大規(guī)模消除并重建的過程。在早期胚胎大規(guī)模去甲基化的過程中，部分區(qū)域仍然維持了生殖細胞中的甲基化水平，這些區(qū)域主要是印跡調(diào)控區(qū)(imprinting control regions，ICR)。ICR 可以被劃分為生殖細胞印跡調(diào)控區(qū)(germ-lineICRs, gICRs)和體細胞印跡調(diào)控區(qū)(somatic ICRs， sICRs)[20]。gICR 指在精子和卵子中就建立的等位基因組序列的差異甲基化區(qū)域，并且gICR 在早期發(fā)育過程中不發(fā)生DNA 的去甲基化；而 sICR 是指只在體細胞中才建立起的等位基因組序列的差異甲基化區(qū)域[21]。哺乳動物早期胚胎的 去甲基化過程是區(qū)域特異性的，在此過程中許多區(qū) 域被保護并不去甲基化，從而使一些父源和母源差 異的甲基化區(qū)域(印跡區(qū)域)能夠維持下來，因此我 們推測選擇性地去甲基化方式可能是導(dǎo)致印跡基因形成的一個重要因素[18]。

生殖細胞發(fā)育過程中全基因組去甲基化及重新建立DNA甲基化圖譜。原始生殖細胞(primordial germ cells， PGCs)是能夠產(chǎn)生雄性和雌性生殖細胞的早期細胞。生殖細胞發(fā)育過程中經(jīng)歷了全基因組的去甲基化及重新建立DNA甲基化圖譜的過程。在小鼠的PGC發(fā)育過程中，發(fā)生了大規(guī)模的去甲基化過程。PGC在 6.5天時起始分化，在13.5天時，平均甲基化水平降至最低點，此時全基因組 DNA 的甲基化水平大約在 5%左右[18]。雄性的PGC細胞在13.5 天后開始重新建立甲基化圖譜，而雌性PGC重新甲基化的時間晚于雄性．經(jīng)過重新甲基化后，雄性生殖細胞的甲基化水平高于雌性生殖細胞，從而形成精子和卵子。人與小鼠的PGC發(fā)育過程 DNA 甲基化動態(tài)非常相似。由于發(fā)育周期不同，人妊娠10～11 周時，PGC的甲基化水平降至最低點，隨后進入重新甲基化過程[22]。研究[23]發(fā)現(xiàn)一部分與代謝和神經(jīng)性疾病相關(guān)的位點也在整體去甲基化的過程 中保留了甲基化修飾。

生殖細胞發(fā)育過程中的DNA甲基化重編程過程中，大部分區(qū)域的甲基化修飾被抹去并重新建立。兩輪重編程過程也存在著許多差異。首先，PGC發(fā)育過程相比早期胚胎發(fā)育過程的DNA去甲基化發(fā)生的更為徹底[24]。此外，兩輪 DNA甲基化重編程過程的差異主要體現(xiàn)在對印跡調(diào)控區(qū)的甲基化控制方面，gICRs 的等位基因特異甲基化的狀態(tài)在 PGC發(fā)育過程隨著去甲基化過程被消除，在隨后的重新甲基化過程中建立，但在早期胚胎發(fā)育的去甲基化過程中，gICRs甲基化的狀態(tài)得到維持[25]DNA 甲基化重編程對于個體發(fā)育的意義有：①從遺傳持續(xù)性的角度，在早期胚胎發(fā)育和原始生殖細胞發(fā)育過程中發(fā) 生的兩輪大規(guī)模 DNA甲基化重編程過程，其目的是為了消除親代在生存過程中產(chǎn)生的異常甲基化修飾，從而避免這些異常對于子代的影響[26]；②從細胞分化能力的角度，DNA甲基化對于細胞命運 決定具有重要意義，是一種限制細胞發(fā)育潛能的表 觀遺傳屏障．在生命循環(huán)的關(guān)鍵時期，如早期胚胎發(fā)育和原始生殖細胞發(fā)育時期，消除這種 DNA甲基化的屏障，有助于重新建立發(fā)育的潛能[27]；③從胚胎發(fā)育特點的角度，哺乳動物發(fā)育過程中兩輪 DNA 去甲基化有助于基因組印跡的形成，基因組印跡是有胎盤的哺乳動物所特有的，有助于調(diào)控胚 胎在母親子宮內(nèi)的體積．我們推測兩輪的全基因組 去甲基化是哺乳動物進化中的重要一步。

2.2 DNA甲基化在衰老過程中的變化

衰老的DNA甲基化模式為總體DNA甲基化水平降低，但某些特定區(qū)域DNA為高甲基化狀態(tài)[28]。人類DNA甲基化的表觀遺傳譜隨年齡增長不斷變化，在不同生活習慣和/或環(huán)境得雙胞胎中更是明顯[29]。這表明老化相關(guān)的DNA甲基化改變部分是由環(huán)境因素引起的。

年齡相關(guān)的低DNA甲基化主要發(fā)生在異染色質(zhì)區(qū)域[30]。相反，超甲基化通常發(fā)生在非甲基化的CGIs 。隨著年齡的增長，一些基因超甲基化也在癌癥細胞和其他年齡相關(guān)疾病中出現(xiàn)[31，32]。

生育力的下降與母親年齡增加有關(guān)，但生育力下降的具體相關(guān)機制仍不清楚?；蚪M印記在胚胎生長發(fā)育和胎盤功能中起著重要作用。而在卵母細胞和受精后早期的胚胎發(fā)育過程中會出現(xiàn)基因組印跡的缺陷。如果DNA甲基化缺陷發(fā)生在卵母細胞發(fā)育過程中，這些缺陷則會在后代中反應(yīng)出來。Yue等[33]研究了年輕小鼠(6～8周)和老年小鼠(35～40周)的卵母細胞和植入前胚胎的DNA甲基化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著母體年齡的增加，卵母細胞和植入前胚胎的DNA甲基化水平顯著降低；此外，老年雌性小鼠的卵裂率、囊胚率以及妊娠率較年輕的雌性小鼠低。與母體衰老相關(guān)的生育力下降可能由卵子發(fā)生過程中的DNA甲基化缺陷和胚胎著床前發(fā)育的缺陷所致。然而，表觀遺傳評價結(jié)果表明，印跡基因H19和SNRPN在受精后3.5天的卵裂球中正常表達，此外，該基因還顯示在受精后10.5天的胚胎及其相應(yīng)胎盤中表達單等位基因。在印跡基因SNRPN、KCNQ1OT1、U2AF1-RS1、PEG1、IGF2R和H19的DMRS(差異甲基化區(qū))的甲基化，以及胚胎和胎盤的全基因組DNA甲基化水平在高齡女性中沒有改變。數(shù)據(jù)表明，能夠發(fā)育到中期妊娠的胚胎能獲得和維持正常的DNA甲基化模式?？偠灾阁w老化對卵子發(fā)育和受精卵植入前發(fā)育過程中的全基因甲基化有不利影響。相比之下，盡管在高齡女性中期妊娠期的不良結(jié)局增加，但在相同時期，甲基化印記在活胎中正常維持。

綜上所述，DNA甲基化與衰老有關(guān)。DNA甲基化的生物學(xué)特征主要有Dnmts、CpG島及DNA去甲基化。人及其他哺乳動物的早期胚胎 DNA 甲基化動態(tài)為配子高甲基化、胚胎低甲基化。生殖細胞發(fā)育過程中伴隨全基因組去甲基化及重新建立DNA甲基化圖譜。隨母體年齡增加，DNA甲基化水平降低，導(dǎo)致生育力下降。隨著DNA甲基化檢測技術(shù)的發(fā)展，特別是全基因組區(qū)域內(nèi)DNA甲基化的可量化分析，與衰老相關(guān)的甲基化標記不僅在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，在臨床研究中也將發(fā)揮重要作用，如可用來監(jiān)測健康狀況并預(yù)測壽命，找到有效的藥物改善衰老機體的功能，靶向治療相關(guān)腫瘤，提高高齡女性的生育能力等。