史柳嫣 辛 偉 位全芳 甘志新 王 丹 胡明冬

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是常見的、發(fā)病率和病死率極高的肺部疾病，以肺部嚴(yán)重的急性炎癥性反應(yīng)為特征，因此，有效地抗炎治療是防治ALI的重要策略之一[1]。近年來，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)在ALI中的重要作用倍受關(guān)注。LncRNA是一類長(zhǎng)度大于200nt的非編碼RNA，lncRNA的異常表達(dá)與多種疾病相關(guān)，如炎癥、腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝疾病等，并密切參與調(diào)節(jié)這些疾病的發(fā)生、發(fā)展[2-7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PACER(p50-associated COX-2 extragenic RNA)可被細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)顯著誘導(dǎo)，通過活化NF-κB 促進(jìn)重要促炎因子COX-2(環(huán)氧合酶2)表達(dá)，密切參與并促進(jìn)炎癥反應(yīng)[8-11]。然而，lncRNA PACER在ALI 發(fā)生中的可能作用及相關(guān)機(jī)制未見報(bào)道。因此，本文在膿毒癥所致急性肺損傷患者的肺泡巨噬細(xì)胞中及LPS致ALI小鼠肺組織中PACER表達(dá)均顯著升高的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察PACER對(duì)ALI的影響并探討其意義，旨在為深入闡明lncRNA PACER在ALI中的作用與機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為進(jìn)一步明確PACER作為ALI防治的靶標(biāo)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，8周齡(購(gòu)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))動(dòng)物中心)。THP-1、RAW264.7細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù))。LPS購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。real time RT-PCR檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)。RNA提取試劑購(gòu)、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Invtrogen公司)。ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D公司。過表達(dá)及敲低PACER慢病毒由上海吉?jiǎng)P公司合成。PCR引物由上海生工公司合成。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 人肺泡巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)： 20例急性肺損傷和健康非吸煙者經(jīng)支氣管肺泡灌洗術(shù)，獲得肺泡灌洗液，經(jīng)4 ℃ 1 000×g 離心10 min后，去除清液，PBS重懸細(xì)胞、再離心、洗滌2次，細(xì)胞再用無血清RPMI 1640 培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育貼壁2 h，除去未黏附細(xì)胞，黏附生長(zhǎng)在培養(yǎng)皿壁的細(xì)胞即為肺泡巨噬細(xì)胞，細(xì)胞用含有10% FBS，100 U/ ml 青霉素100 μg/ ml 鏈霉素的RPMI1640 液培養(yǎng)。

2. ALI 小鼠模型建立與分組、處理： 按照每只小鼠10 mg/kg LPS 的劑量，進(jìn)行腹腔注射，小鼠注射LPS后出現(xiàn)寒戰(zhàn)，呼吸頻率加快，活動(dòng)力降低，毛發(fā)聳立、解稀水樣糞便等癥狀。將小鼠隨機(jī)分為正常組(sham)和模型組，其中模型組又分為對(duì)照組(control siRNA)、敲低組(PACER siRNA)，每組10只。正常組腹腔注射生理鹽水0.2 ml；對(duì)照組腹腔注射LPS制備膿毒癥小鼠模型，于0.5 h后，生理鹽水組尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml；敲低組腹腔注射LPS制備膿毒癥小鼠模型，于0.5 h后，尾靜脈注射PACER siRNA慢病毒0.2 ml。

3. HE染色觀察肺臟組織的病理學(xué)改變： 取各處理小鼠肺臟組織，置于4% 的多聚甲醛中固定24 h，然后用石蠟包埋，制成5 μm 切片并做HE 染色，最后在倒置顯微鏡下觀察肺臟組織的病理學(xué)變化。

4. Real time PCR： 采用TRizol 試劑RNA提取試劑，根據(jù)試劑說明方法，提取人肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠肺組織的總RNA。經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，按照試劑說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以 cDNA 為模板，按照試劑說明，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)人和小鼠PACER、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)。引物如下： hPACER F: 5’-TGTAAATA GTTAATGTGAGCTCCACG-3’，R: 5’-GCAAATTCTGGCCATCGC-3’；hIL-6 F: 5’-CAATGA GGAGACTTGCCTGG-3’，R: 5’-GGCATTTGTGGTTGGGTCAG-3’；hTNF-α F: 5’-TCTGGG CAGGTCTACTTTGG-3’，R: 5’-GGTTGAGGGTGTCTGAAGGA-3’；mPACER F: 5’-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3’，R: 5’-CAATTTGCCTGGTGAATGATTC-3’；mIL-6 F: 5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’，R: 5’-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3’；mTNF-α F: 5’-CAAACCACCAAGTGGAGGAG-3’，R: 5’-GTGGGTGAGGAGCACGTAGT-3’，內(nèi)參照β-引物序列如下： hβ-actin F: 5’-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3’，R: 5’-GAAG TGGGGTGGTTTTAGGA-3’；mβ-actin F: 5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3’，R: 5’-GGGG TGTTGAAGGTCTCAAA-3’。

5. 細(xì)胞和血清炎性因子的檢測(cè)： 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞和小鼠血清TNF-α和IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒所附說明書的操作步。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、lncRNA PACER在ALI患者和小鼠模型中表達(dá)顯著升高

20例膿毒癥所致急性肺損傷患者和健康非吸煙者經(jīng)支氣管肺泡灌洗術(shù)，獲得肺泡巨噬細(xì)胞；LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型(n=10)，取肺組織，real-time PCR檢測(cè)lncRNA PACER的表達(dá)，結(jié)果顯示相對(duì)于正常組，ALI患者(見圖1A)和小鼠ALI模型組(圖1B)，lncRNA PACER表達(dá)均顯著升高。

圖1 lncRNA PACER在ALI患者(A)和小鼠(B)模型中的表達(dá)；與Control 組比較，**P<0.01

二、lncRNA PACER促進(jìn)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，

過表達(dá)PACER慢病毒感染人單核THP-1和鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，過表達(dá)組細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)均升高，其靶基COX-2的表達(dá)也顯著升高，見圖2 A-C；而細(xì)胞轉(zhuǎn)染PACER siRNA 后，炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)均降低，COX-2的表達(dá)也顯著降低，見圖2D-F。

三、敲低lncRNA PACER減弱ALI小鼠炎癥反應(yīng)

LPS致ALI小鼠，尾靜脈注射PACER siRNA慢病毒后，檢測(cè)小鼠肺組織和血清炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，PACER敲低組小鼠肺組織和血清中炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá)均顯著降低，見圖3A，3B，同時(shí)，PACER敲低組小鼠肺組織損傷程度明顯減弱，見圖3C-E。

討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥所致急性肺損傷患者的肺泡巨噬細(xì)胞中及LPS致ALI小鼠肺組織中PACER表達(dá)均顯著升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PACER可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，以及ALI小鼠的炎癥反應(yīng)和肺損傷，為進(jìn)一步明確PACER作為ALI防治的靶標(biāo)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

ALI是各種直接和間接因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，形成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，所導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全，其發(fā)展至嚴(yán)重階段為死亡極其高的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[12]。ALI/ ARDS的發(fā)生與體內(nèi)一系列基因表達(dá)調(diào)控的失調(diào)密切相關(guān)，因此進(jìn)一步探討其病理過程中基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制對(duì)ALI/ARDS的防治具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。

炎癥及其更為嚴(yán)重的膿毒癥(sepsis)是導(dǎo)致ALI/ARDS的主要因素之一。因此，有效地抗炎治療是防治ALI/ARDS的重要策略之一。近年來，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的lncRNA在ALI中的重要作用倍受關(guān)注。目前大量的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在生物學(xué)過程中充當(dāng)多種媒介(如充當(dāng)分子支架、分子向?qū)?、分子誘餌、信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑等)，其通過影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、可變剪接調(diào)控、表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄后和翻譯調(diào)控等多種機(jī)制參與機(jī)體正常和病理生理過程[13-17]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA也密切參與了ALI的發(fā)生發(fā)展過程。據(jù)報(bào)道lncRNA CASC2通過調(diào)節(jié)miR-144-3p/AQP1軸減少肺泡上皮細(xì)胞促進(jìn)ALI的發(fā)展[18-21]。抑制LncRNA MALAT1可上調(diào)miR-146a進(jìn)而減弱ALI 的炎癥反應(yīng)[22]。脂質(zhì)受體激動(dòng)劑BML-111可通過抑制lncRNA MALAT1的表達(dá)減弱ALI[23]。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥所致ALI患者和小鼠ALI模型中l(wèi)ncRNA PACER表達(dá)均顯著升高，提示lncRNA PACER參與了ALI的炎癥反應(yīng)。

圖2 lncRNA PACER促進(jìn)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)結(jié)果；注：與NC，Control 組比較，**P<0.01

圖3 敲低lncRNA PACER減弱ALI小鼠炎癥反應(yīng)(HE×100)；注：與Control 組比較，**P<0.01

PACER是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)可激活環(huán)氧酶-2(COX-2)表達(dá)的lncRNA。COX-2密切參與炎癥、腫瘤等多種病理生理過程。在炎癥、損傷和致癌物質(zhì)等刺激下，COX-2在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究表明，多個(gè)通路可誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)，包括通過激活PKC、Ras和Wnt通路中MAPK激酶(ERK、JNK、p38)[24-28]。此外，在COX-2啟動(dòng)上轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、AP1、CREB C/EBP、NF-IL6、MEF2、TCF4/LEF1等也可促進(jìn)COX-2的轉(zhuǎn)錄活化，誘導(dǎo)其表達(dá)[29-30]。而新近的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PACER 在COX-2的上游與抑制COX-2的啟動(dòng)子NF-κB p50相結(jié)合，轉(zhuǎn)而促進(jìn)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300的募集，轉(zhuǎn)而促進(jìn)COX-2的表達(dá)。那么該作用機(jī)制是否與ALI的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，以及l(fā)ncRNA PACER在ALI中的具體作用尚不清楚。因此，在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激人單核THP-1和鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中，PACER可顯著誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，且其重要靶基因COX-2的表達(dá)也明顯被誘導(dǎo)，并且在ALI模型鼠中，PACER的表達(dá)升高，且抑制PACER可減弱ALI小鼠的炎癥反應(yīng)。這提示lncRNA PACER能通過誘導(dǎo)COX-2促進(jìn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而密切參與ALI的發(fā)生發(fā)展，但其與ALI的具體作用及機(jī)制仍需深入研究。

綜上所述，本文在膿毒癥所致急性肺損傷患者的肺泡巨噬細(xì)胞中及LPS致ALI小鼠肺組織中PACER表達(dá)均顯著升高的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察了PACER對(duì)ALI的影響并探討了其意義，為深入闡明lncRNA PACER在ALI中的作用與機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為進(jìn)一步明確PACER作為ALI防治的靶標(biāo)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。