陳 偉 李 華 唐心蔚 劉雪萍

支氣管肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病，在惡性腫瘤中，發(fā)病率和死亡率占居首位[1]。目前經(jīng)過(guò)手術(shù)和傳統(tǒng)的化療及放療肺癌仍難以控制，且副作用大，五年生存率僅為15%～20%[2]。小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)是肺癌中重要的病理類型，占肺癌的15%～20%，惡性程度較高，雖然其對(duì)化療敏感性較高，但是由于分化差、增殖快且極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致對(duì)藥物易產(chǎn)生耐藥性[3]。因此，尋找新的治療途徑和靶標(biāo)，是小細(xì)胞肺癌治療的關(guān)鍵。Rab26是Rab家族近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的成員，主要參與細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)、分裂和基因轉(zhuǎn)錄[4]。既往研究表明，Rab26可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制其遷移[5]，在對(duì)抗腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展中有著重要作用，但是在小細(xì)胞肺癌中的研究尚無(wú)報(bào)道。因此，本文以Rab26過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體和siRNA序列作用小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞，觀察Rab26對(duì)H446細(xì)胞增殖及細(xì)胞遷移的影響，旨在為小細(xì)胞肺癌的防治提供新的治療靶點(diǎn)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

Rab26過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pDsRed monomer C1載體)和siRNA(序列：GUGUUA- CCCAUGCCUACUATT UAGUAGGCAUGGGUAACACTT，Cy3標(biāo)記)由生工構(gòu)建，1649完全培養(yǎng)基、OptiMEM、胰蛋白酶購(gòu)自HyClone公司(美國(guó))，轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自羅氏公司，RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物技術(shù)公司，Rab26、GAPDH抗體購(gòu)于艾博抗貿(mào)易有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. H446細(xì)胞的培養(yǎng): H446細(xì)胞置于37 ℃、含5% CO2的1 640培養(yǎng)基(含5%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每次實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞均選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染: 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照細(xì)胞組、Rab26質(zhì)粒過(guò)表達(dá)組、Rab26siRNA組。接種H446細(xì)胞接種于6孔板了培養(yǎng)1 d(1×105個(gè)/孔)，顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)融合情況，待腫瘤細(xì)胞達(dá)60%的融合率時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，且在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)先用PBS洗滌6孔板，更換培養(yǎng)基為Opti-MEM，同時(shí)分別將質(zhì)粒、siRNA與轉(zhuǎn)染試劑按照比例稀釋(參照說(shuō)明書)，對(duì)照組則加入等量稀釋液培養(yǎng)液。6 h后更換為完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

3. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率: 0.25%的胰酶處理轉(zhuǎn)染后的H446細(xì)胞，以離心半徑8 cm，2 000 r/min 離心10 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入300 μl PBS重懸細(xì)胞，混勻，待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

4. RT-PCR檢測(cè)Rab26 mRNA的表達(dá): Trizol提取總RNA，Rab26引物上游: 5′-TCAAGGGCGGCAGCAGGA-3′，下游: 5′-GAGTACGCCCAGCACGAC-3′；GAPDH引物上游: 5′-GCAAATTCCAC GGCACAGTCA-3′，引物下游: 5′-TCACGCCACAGTTTCCCAGAG-3′。按照RT-PCR 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其中Rab26 擴(kuò)增長(zhǎng)度為298 bp，GAPDH擴(kuò)增長(zhǎng)度為450 bp，條件參照既往文獻(xiàn)[5]。

5. Western blot 檢測(cè)Rab26蛋白的表達(dá): 提取總蛋白，4 ℃，以離心半徑8 cm，12 000 r/min 離心10 min，檢測(cè)總蛋白濃度，按需要調(diào)蛋白濃度，向蛋白液中加入Loading buffer，煮沸8 min變性。配制分離膠、濃縮膠，SDS-PAGE凝膠電泳，80 V 40 min，120 V 1.0 h后，350 mA轉(zhuǎn)膜45 min，將PVDF膜封閉2 h后，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜；第二天TBST漂洗至少3次，每次10 min，孵二抗1 h，TBST漂洗后顯色。

6. MTT檢測(cè)H446細(xì)胞增殖: H446細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)(1×103/孔)，加入200 μl培養(yǎng)液，各組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，再進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染后24 h和48 h后，向每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，再培養(yǎng)4 h后，棄上清液，加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，混勻。490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)活力，計(jì)算光密度值。細(xì)胞生長(zhǎng)活力=[實(shí)驗(yàn)組光密度值/對(duì)照組48 h光密度值]× 100%。

7. 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H446細(xì)胞遷移: H446細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(1×105/孔)，待細(xì)胞在孔內(nèi)融合率達(dá)100%后，用tip頭在6孔板中央畫直線。并用PBS洗滌1次，繼續(xù)加入10%FBS的1 640完全培養(yǎng)基，同時(shí)顯微鏡下照相記錄0 h位置；24 h后，更換培養(yǎng)基后照相，觀察各組腫瘤細(xì)胞遷移情況；48 h，重復(fù)觀察。

常用的混合材有：火山灰、粉煤灰、?；郀t礦渣、煤矸石、沸石、石灰石、石英巖、爐渣、硅錳渣、硫酸鋁渣等。有些材料的內(nèi)比表面積大，如沸石、硫酸鋁渣吸水量大，爐渣、礦渣呈多孔結(jié)構(gòu)，這些材料與外加劑的相容性均較差。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 15.0 for windows 和Image-Pro Plus 10.0對(duì)數(shù)據(jù)和圖像進(jìn)行分析，每組別至少重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)方法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Rab26過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染H446細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

各組轉(zhuǎn)染48 h后，Rab26質(zhì)粒過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染效率達(dá)(76.8±4.3)%；siRNA組轉(zhuǎn)染效率為(79.5±3.57)%，見圖1，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染效率較高，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供較好的數(shù)據(jù)支撐。

圖1 各組轉(zhuǎn)染H446細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

二、Rab26在基因和蛋白水平的改變

轉(zhuǎn)染48 h后，檢測(cè)每組Rab26在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)組Rab26 mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，而Rab26 siRNA組在mRNA和蛋白水平表達(dá)較對(duì)照組表達(dá)均顯著減少(P<0.05)，見圖2。結(jié)果表明為有效轉(zhuǎn)染，在基因和蛋白水平都發(fā)揮效應(yīng)。

圖2 各組間Rab26mRNA和蛋白表達(dá)；注： *:P<0.05，與正常組比較

三、Rab26對(duì)H446細(xì)胞增殖的影響

圖3 各組細(xì)胞存活率；注：*:P<0.05，與對(duì)照24 h比較；#：P<0.05，與對(duì)照48 h比較

四、Rab26對(duì)H446細(xì)胞遷移的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組、質(zhì)粒過(guò)表達(dá)組、siRNA組轉(zhuǎn)染24 h后，遷移速度分別為(0.53±0.03)μm/min、(0.21±0.04)μm/min、(0.61±0.02)μm/min；轉(zhuǎn)染48 h后各組遷移速度分別為(0.32±0.04)μm/min、(0.22±0.04)μm/min、(0.42±0.03)μm/min，在24、48 h時(shí)過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移速度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，siRNA組在24、48 h時(shí)遷移速度則顯著高于對(duì)照組，見圖4。

討論

近年來(lái)肺癌的發(fā)生呈逐年上升趨勢(shì)，且呈年輕化，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。尤其是隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，環(huán)境污染導(dǎo)致的霧霾天氣在全國(guó)各地出現(xiàn)的頻率亦越來(lái)越高，也引發(fā)肺癌的發(fā)病率和死亡率日趨增加，約2/3的患者在診斷時(shí)發(fā)現(xiàn)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前小細(xì)胞肺癌的治療手段主要是化療及放療，盡管近年來(lái)其治療策略也處于不斷探索和發(fā)展中，一定程度上提高了小細(xì)胞肺癌治療的緩解率，但是對(duì)改善患者的生存期仍是極為有限。據(jù)統(tǒng)計(jì)，廣泛期和局限期小細(xì)胞肺癌的5年生存率僅有2%和10%，且局限期患者的中位生存時(shí)間僅為18～20個(gè)月，廣泛期患者的中位生存時(shí)間則僅有8～12個(gè)月[6-7]。因此，亟待探索新的治療策略以提高肺癌患者的生存期和生活質(zhì)量。

研究表明肺癌的發(fā)生發(fā)展受多因子、多因素、多階段控制，其中癌細(xì)胞的增殖和凋亡失衡，以及早期的轉(zhuǎn)移是癌癥發(fā)生的重要原因[8]，其中增殖和轉(zhuǎn)移為惡性腫瘤的最主要特征。已知腫瘤細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)主要由于細(xì)胞的增殖失控所致，因此抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖是控制腫瘤增殖的關(guān)鍵； 而腫瘤遷移的過(guò)程主要包括腫瘤細(xì)胞的極化以及偽足生成，進(jìn)而偽足與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，導(dǎo)致細(xì)胞體收縮、周期基質(zhì)和細(xì)胞尾端解離，最終引起腫瘤細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng)，同時(shí)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移亦是導(dǎo)致肺癌患者預(yù)后不良，5年生存率低的主要原因[9-11]。Rab26屬于Ras超家族，首次被發(fā)現(xiàn)于小鼠胰腺細(xì)胞中，其調(diào)控胰腺細(xì)胞中溶酶體的釋放[12-14]。后期研究又發(fā)現(xiàn)其可以通過(guò)激活MIST1調(diào)節(jié)溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)，并參與細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸，在細(xì)胞囊泡內(nèi)順式轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用[15-17]。既往研究表明Rab26除了參與細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)受體的轉(zhuǎn)運(yùn)之外，在細(xì)胞的凋亡、自噬、遷移等生命進(jìn)程也扮演了重要角色[18-22]。

圖4 各組細(xì)胞遷移情況

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rab26在H446細(xì)胞中有表達(dá)，且通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、siRNA的作用可調(diào)控Rab26 在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，提示Rab26可能在肺癌細(xì)胞的發(fā)展進(jìn)程中有重要作用。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Rab26過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后H446細(xì)胞的增殖減弱，而轉(zhuǎn)染Rab26 siRNA后則促進(jìn)了H446細(xì)胞的增殖，表明Rab26可以抑制H446細(xì)胞的增殖；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示Rab26過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞的遷移也顯著受到抑制，Rab26 siRNA組則加速了H446細(xì)胞的遷移能力，表明Rab26可有效抑制H446細(xì)胞的遷移，提示Rab26在調(diào)控H446細(xì)胞的增殖和遷移能力中有重要作用，其有望作為小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

鑒于細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，因此通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移則成為腫瘤治療的重要方向。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Rab26在小細(xì)胞肺癌中伴有重要角色，早期的研究表明，Rab家族其他成員與腫瘤的遷移和侵襲有密切關(guān)系。目前已發(fā)現(xiàn)Rab5參與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，可降低腫瘤細(xì)胞分化性并促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移的能力[23-25]；Rab39和Rab21參與腫瘤細(xì)胞中胞內(nèi)定位及內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)促使腫瘤的侵襲和黏附[26-27]；Rab25和Rab8與胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲密切相關(guān)[28-29]；Rab11和Rab13參與腫瘤細(xì)胞偽足的形成，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲[30-31]。可見，除Rab26 以外，其他Rab蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用，并進(jìn)一步影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，進(jìn)而決定細(xì)胞的生命進(jìn)程[32]。因此，結(jié)合Rab蛋白的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)作用，研究Rab蛋白在腫瘤中的作用和機(jī)制可為肺癌患者的治療提供新的思路。