李王平 馬李杰 潘 蕾 金發(fā)光

白藜蘆醇是廣泛存在于自然界的一種多酚類化合物，具有很強的生物活性[1-4]。多項研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對多種惡性腫瘤細(xì)胞均有明顯的抑制作用，主要機制為抑制蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶的活性、抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化、凋亡等[5-8]。小細(xì)胞肺癌惡性程度高，倍增時間短，轉(zhuǎn)移早而廣泛，雖然對化療、放療敏感，初治緩解率高，但極易發(fā)生繼發(fā)性耐藥，容易復(fù)發(fā)，截止目前，小細(xì)胞肺癌的治療方法仍以放化療為主。小細(xì)胞肺癌的治療效果在過去的幾十年中沒有明顯改善，對于小細(xì)胞肺癌靶向治療及免疫治療的相關(guān)研究較為滯后[9-13]。雖然已有一些針對小細(xì)胞肺癌靶向治療的臨床實驗，但目前尚未有明確的療效報道，部分患者使用免疫調(diào)節(jié)劑，但療效欠佳[14-15]。本文擬探討白藜蘆醇對人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞增殖的抑制作用及誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡的作用及可能的機制，旨在為小細(xì)胞肺癌化療治療提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

一、實驗材料

人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院呼吸內(nèi)科實驗室提供。FBS培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，MTT、白藜蘆醇購自Sigma 公司，DMSO 購自Invitrogen 公司，胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司，AV/PI染料購自碧云天生物技術(shù)公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BD)。主要儀器設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國熱電公司)，光學(xué)顯微鏡、倒置拍攝顯微鏡(蔡司公司)，低速離心機(湘儀)，酶標(biāo)檢測儀(賽默飛)，流式細(xì)胞儀(BD)，DHE熒光探針(碧云天生物技術(shù)公司)，JC-10膜電位探針(ab112133)。

二、研究方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)： 觀察細(xì)胞生長情況，進(jìn)行傳代擴增。觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞生長密度80%～90%，可以進(jìn)行傳代；將培養(yǎng)皿中原有培養(yǎng)液棄去，用PBS洗2次； 加入0.25%的胰酶消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞變圓后吸去胰酶； 加入完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞吹打為單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞按照一定比例進(jìn)行分離，加入適量的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中；每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，擴增到足夠的細(xì)胞量后開始實驗，一般2 d可傳一代。

2. MTT檢測

(1)白藜蘆醇的細(xì)胞毒性觀察及實驗濃度篩選： 將處于對數(shù)生長期時的細(xì)胞，以5×104cells/ml密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔150 μl，每個濃度梯度3個復(fù)孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)；將白藜蘆醇分別用完全培養(yǎng)基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，50 μg/ml，60 μg/ml，70 μg/ml，80 μg/ml，90 μg/ml，100 μg/ml，110 μg/ml和120 μg/ml按照實驗分組給藥處理，以CK、DMSO作為對照；培養(yǎng)24 h后在每孔加入15 μl的MTT，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育3～4 h；棄上清，加入200 μl的DMSO，室溫?fù)u床震蕩10 min；酶標(biāo)儀492 nm波長測出同一時間點OD值，用測得的OD值進(jìn)行細(xì)胞增殖影響的分析。

(2) 根據(jù)前期濃度篩選結(jié)果進(jìn)一步觀察白藜蘆醇的細(xì)胞毒性作用特點： 將處于對數(shù)生長期時的細(xì)胞，以5×104cells/ml密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔150 μl，每個濃度梯度3個復(fù)孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)；實驗分組1：將白藜蘆醇分別用完全培養(yǎng)基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，給藥處理，設(shè)空白對照，孵育24 h；實驗分組2：將白藜蘆醇用完全培養(yǎng)基稀釋至30 μg/ml，給藥處理，分別培養(yǎng)12 h，24 h和48 h，設(shè)空白對照；每孔加入15 μl的MTT，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育3～4 h；棄上清，加入200 μl的DMSO，室溫?fù)u床震蕩10 min；酶標(biāo)儀492 nm波長測出同一時間點OD值，用測得的OD值進(jìn)行細(xì)胞增殖影響的分析。

3. 流式檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)ROS及線粒體膜電位： 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以細(xì)胞密度為1×105個/ml接種于6孔板中，每孔3 ml，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；實驗分組1：將白藜蘆醇分別用完全培養(yǎng)基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，設(shè)空白對照，給藥處理24 h；實驗分組2：將白藜蘆醇用完全培養(yǎng)基稀釋至30 μg/ml，給藥處理，分別培養(yǎng)12 h，24 h和48 h，設(shè)空白對照；實驗分組：分別用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞后，以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min，然后收集細(xì)胞；用預(yù)冷的1×PBS(4 ℃)重懸細(xì)胞，以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞，然后加入300 μl的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μl的Annexin V-FITC并混勻，避光室溫孵育15 min。加入10 μl的PI染色，混勻細(xì)胞，繼續(xù)避光孵育10 min；用PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。

4. 流式檢測ROS： 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以細(xì)胞密度為1×105個/ml接種于6孔板中，每孔3 ml，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；實驗分組1：將白藜蘆醇分別用完全培養(yǎng)基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，設(shè)空白對照，給藥處理24 h；實驗分組2：將白藜蘆醇用完全培養(yǎng)基稀釋至30 μg/ml，給藥處理，分別培養(yǎng)3、6、12、24 h，設(shè)空白對照；分別用胰酶消化收集以上各實驗組細(xì)胞后，以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min；用PBS清洗細(xì)胞，加入DHE熒光染料，37 ℃下避光孵育30 min；PBS重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行ROS檢測。

5. 流式檢測線粒體膜電位： 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以細(xì)胞密度為1×105個/ml接種于6孔板中，每孔3 ml，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；實驗分組1：將白藜蘆醇分別用完全培養(yǎng)基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，設(shè)空白對照，給藥處理24 h；實驗分組2：將白藜蘆醇用完全培養(yǎng)基稀釋至30 μg/ml，給藥處理。分別培養(yǎng)3、6、12、24 h，設(shè)空白對照；用胰酶消化收集以上各實驗組細(xì)胞后，以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min；用PBS清洗細(xì)胞，加入JC-10熒光染料，37 ℃避光孵育45 min；PBS重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行JC-10檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、白藜蘆醇對H446細(xì)胞的毒性觀察及MTT檢測結(jié)果

1. 白藜蘆醇作用于H446細(xì)胞后形態(tài)學(xué)變化： 白藜蘆醇給藥后，觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度的白藜蘆醇可造成不同比例的細(xì)胞死亡，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞死亡增多。細(xì)胞死亡后，出現(xiàn)細(xì)胞圓縮，失去原有形態(tài)，細(xì)胞不貼壁。在光鏡下(100×)可以觀察到細(xì)胞變得不透亮，失去活性，隨著濃度增加，異常細(xì)胞明顯增多。而對照組細(xì)胞形態(tài)正常，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)展開，細(xì)胞透亮，細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞活性高，見圖1。

2. MTT檢測不同濃度白藜蘆醇對H446細(xì)胞增殖的抑制作用： MTT檢測發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇從30 μg/ml濃度開始，H446細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯抑制，40 μg/ml時細(xì)胞抑制率迅速上升，且隨著給藥濃度增加，其抑制率增加，到達(dá)一定濃度后其細(xì)胞抑制率不再上升，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01，見圖2。

圖2 不同濃度白藜蘆醇對H446細(xì)胞的抑制率

3. 白藜蘆醇對H446細(xì)胞增殖抑制作用的特點觀察

(1)白藜蘆醇不同濃度下及作用不同時間后細(xì)胞形態(tài)變化：從形態(tài)學(xué)變化可以看出，隨著白藜蘆醇濃度增加和白藜蘆醇作用時間的延長，受損細(xì)胞數(shù)增多，受損程度變重，光鏡下可觀察到細(xì)胞形態(tài)不貼壁，圓縮，透亮度變低，異常細(xì)胞數(shù)目隨著作用濃度和作用時間的增加而增多，見圖3、4。

(2)MTT檢測白藜蘆醇不同濃度下及作用不同時間后對H446細(xì)胞增殖的抑制作用： 實驗結(jié)果表明，與CK相比較，Res在30 μg/ml時開始產(chǎn)生細(xì)胞抑制，40 μg/ml時其抑制率顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明Res的細(xì)胞毒性作用有濃度依賴的特點；而作用不同時間細(xì)胞抑制率結(jié)果顯示，隨著作用時間的延長，細(xì)胞抑制率增加，在作用24 h時產(chǎn)生明顯抑制，作用48 h時抑制率接近70 %，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01，說明Res的細(xì)胞抑制有時間依賴的特點，見圖5。

圖1 白藜蘆醇作用于H446細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)變化(100×)；注：A：100～120 μg/ml濃度，細(xì)胞完全死亡；B：70～90 μg/ml濃度，大部分細(xì)胞出現(xiàn)圓縮，失去原有形態(tài)，細(xì)胞不貼壁；C：40～60 μg/ml濃度，50%以上細(xì)胞不透亮，失去活性；D：20～30 μg/ml大部分細(xì)胞狀態(tài)良好，CK組細(xì)胞形態(tài)展開，透亮，細(xì)胞狀態(tài)良好，活性高；E：DSMO組大部分細(xì)胞狀態(tài)良好

圖3 不同濃度白藜蘆醇作用時細(xì)胞形態(tài)變化(100×)

圖4 30 μg/ml白藜蘆醇作用不同時間后細(xì)胞形態(tài)變化(100×)

圖5 不同濃度白藜蘆醇及作用不同時間(30 μg/ml)細(xì)胞抑制率

二、流式檢測細(xì)胞凋亡

1. 不同濃度白藜蘆醇作用后H446細(xì)胞凋亡變化： 流式檢測結(jié)果顯示，與CK組相比，不同濃度白藜蘆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡程度不同，隨著白藜蘆醇給藥濃度的增加，細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加，在40 μg/ml時凋亡比例增加顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖6、7。

圖6 不同濃度白藜蘆醇流式檢測的細(xì)胞凋亡變化

圖7 不同濃度白藜蘆醇致H446細(xì)胞凋亡率

凋亡檢測結(jié)果說明白藜蘆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與濃度相關(guān)，具有濃度依賴性的特點。

2. 白藜蘆醇作用不同時間H446細(xì)胞凋亡變化： 流式檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CK組相比，給藥時間不同，導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡程度不同。作用24 h后，細(xì)胞凋亡比例顯著上升，作用48 h后凋亡比例超過50%，說明隨著給藥時間的延長，細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，凋亡率增加，Res的促細(xì)胞凋亡作用有時間依賴性特點，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖8、9。

三、流式細(xì)胞儀檢測ROS

1. 不同濃度白藜蘆醇作用后細(xì)胞內(nèi)ROS釋放變化： 流式細(xì)胞儀熒光測量結(jié)果顯示，隨著白藜蘆醇濃度增加，細(xì)胞內(nèi)ROS釋放增多。40 μg/ml 濃度時ROS釋放量顯著增多，說明ROS釋放有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.01)，見圖10、11。

圖8 30 μg/ml白藜蘆醇作用不同時間流式檢測的細(xì)胞凋亡變化

圖9 30 μg/ml 白藜蘆醇作用不同時間H446細(xì)胞凋亡率

圖10 不同濃度白藜蘆醇給藥時細(xì)胞內(nèi)ROS釋放情況

圖11 不同濃度白藜蘆醇給藥時細(xì)胞內(nèi)ROS釋放量

2. 白藜蘆醇給藥不同時間細(xì)胞內(nèi)ROS釋放變化： 由流式檢測結(jié)果可以看出，在Res給藥后細(xì)胞內(nèi)ROS逐漸釋放，隨著白藜蘆醇給藥時間延長，細(xì)胞內(nèi)ROS釋放量逐漸增多，細(xì)胞ROS釋放有時間依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖12、13。

圖12 30 μg/ml 白藜蘆醇給藥不同時間細(xì)胞內(nèi)ROS釋放情況

圖13 30 μg/ml白藜蘆醇給藥不同時間細(xì)胞內(nèi)ROS釋放量

四、流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位

1. 不同濃度白藜蘆醇給藥后線粒體膜電位變化： 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與CK組相比，白藜蘆醇給藥濃度不同，線粒體膜電位的下降程度也不同，隨著濃度的增加，下降程度增加，白藜蘆醇濃度40 μg/ml 時線粒體膜電位下降最為顯著，有濃度依賴的特點。即隨著濃度的增加，線粒體膜電位下降增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖14、15。

圖14 不同濃度白藜蘆醇給藥后線粒體膜電位變化

圖15 不同濃度白藜蘆醇給藥后線粒體膜電位下降率

2. 流式細(xì)胞儀檢測白藜蘆醇作用不同時間線粒體膜電位變化： 流式結(jié)果顯示，與CK組相比，隨著白藜蘆醇給藥時間的延長，線粒體膜電位下降更加明顯，給藥24 h下降最為明顯，呈現(xiàn)時間依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖16、17。

討論

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，主要來源于花生 、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有很強的生物活性，近年來因其由于具有防癌及抗癌作用備受研究關(guān)注[16]。研究顯示白藜蘆醇對眾多的腫瘤具有體外細(xì)胞毒性效應(yīng)，包括骨髓瘤、淋巴瘤、乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌、前列癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、甲狀腺癌等[17-19]。研究表明白藜蘆醇的抗增殖活性與刺激癌細(xì)胞凋亡有關(guān)[20-23]。有人提出，細(xì)胞凋亡的激活可能是化療藥物破壞癌細(xì)胞的一種可能機制[24]。在很多人體腫瘤中，細(xì)胞凋亡受損，說明細(xì)胞凋亡功能的破壞是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞的重要因素[25]。

圖16 30 μg/ml 白藜蘆醇給藥不同時間線粒體膜電位變化

圖17 30 μg/ml 白藜蘆醇給藥不同時間線粒體膜電位下降率

本文先采用了濃度篩選的方法，即通過不同濃度的白藜蘆醇作用于H446細(xì)胞，觀察其毒性作用變化與藥物濃度之間的關(guān)系。細(xì)胞毒性研究結(jié)果提示，白藜蘆醇作用于H446細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生了明顯變化，而且不同的濃度造成的損傷程度不同，在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)了不同比例的細(xì)胞死亡。 根據(jù)濃度梯度觀察結(jié)果，選擇30 μg/ml白藜蘆醇進(jìn)一步觀察其對H446細(xì)胞的毒性作用特點，觀察其毒性作用是否與作用時間有相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，隨著白藜蘆醇作用時間的增加，受損細(xì)胞變多，受損程度變重。MTT檢測結(jié)果提示白藜蘆醇可對H446細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制，其抑制率隨濃度、時間而增加，抑制率增加的特點，表現(xiàn)為濃度和時間依賴，并與細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果相符。

線粒體是人體供能物質(zhì)產(chǎn)生的最主要場所，ATP生成的任一過程受阻，氧化呼吸鏈電子功能傳遞障礙，都會導(dǎo)致細(xì)胞供能和組織代謝發(fā)生異常，導(dǎo)致機體發(fā)生異常[26]。腫瘤細(xì)胞由于其線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，因此不能發(fā)揮正常的產(chǎn)能功能，其代謝會發(fā)生紊亂，繼而導(dǎo)致腫瘤的不斷發(fā)展[27-29]。細(xì)胞受到凋亡因素刺激后，線粒體的功能和結(jié)構(gòu)都會發(fā)生異常，線粒體呼吸鏈氧化磷酸化脫偶，細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多，活性氧生成達(dá)到一定程度后可使線粒體腫脹，導(dǎo)致線粒體膜的通透性改變；ROS可促發(fā)和加速線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔的異常開放，導(dǎo)致ROS生成進(jìn)一步增多，形成正反饋，使線粒體膜電位下降加速至不可逆，發(fā)生細(xì)胞凋亡[30]。

本文對白藜蘆醇作用于H446細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡、活性氧及線粒體膜電位3個指標(biāo)進(jìn)行了觀察，這些觀察指標(biāo)與線粒體功能密切相關(guān)，并從不同濃度、不同時間來進(jìn)行觀察。實驗結(jié)果表明，白藜蘆醇可誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，且其作用具有時間依賴和濃度依賴的特點，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01。

細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致線粒體功能障礙，可引起ROS生成增多，而ROS生成增多可使線粒體腫脹，線粒體腫脹后通透性增高，使得線粒體膜電位的電壓平衡不能維持，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，功能發(fā)生異常，線粒體功能發(fā)生異常后，又可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此，以上因素相互作用、相互影響，形成因果循環(huán)。本文結(jié)果顯示白藜蘆醇對H446細(xì)胞的抑制與線粒體功能障礙密切相關(guān)。這一途徑在Luo 等[31]研究中亦得到證實，該研究結(jié)果認(rèn)為白藜蘆醇可通過ROS介導(dǎo)的DNA損傷誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞早衰。另一項關(guān)于白藜蘆醇誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞A549的研究結(jié)論，亦認(rèn)為白藜蘆醇的促細(xì)胞凋亡功能與線粒體功能障礙相關(guān)[32]。

綜述所述，白藜蘆醇對H446細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，可誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡，細(xì)胞內(nèi)ROS釋放增多，并進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體膜電位下降，其作用效果具有濃度依賴和時間依賴的特點。白藜蘆醇可通過線粒體功能障礙途徑誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡。