丁雨迪 韋球 張真強 王可

糖尿病患者最常見的嚴重感染是糖尿病足合并感染[1]，而銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是在糖尿病足表面感染的組織中培養(yǎng)出的最常見的革蘭氏陰性菌[2]。糖尿病及相關感染性疾病已經(jīng)成為一項棘手的、重要的公共衛(wèi)生問題。PA 所致的感染性疾病具有持續(xù)時間長、難治性、反復性的特點，這一特點與其泳動、群集、蹭動運動能力有關[3]。運動能力下降的細菌對抗生素和宿主免疫系統(tǒng)具有很強的抵抗力，從而導致嚴重的臨床問題，引起許多慢性和難治性感染疾病的反復發(fā)作。環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）在PA 運動能力的調控中起關鍵作用。

中國2 型糖尿病診治指南（2017年版）指出：糖尿病合并感染如肺部感染、皮膚感染、足部潰瘍以及合并囊性纖維化的患者均推薦胰島素控制血 糖[4]。胰島素對胞內c-di-GMP 不同表達量PA 運動能力影響的機制尚未闡明，本研究觀察胰島素對不同c-di-GMP 表達的PA 菌株的泳動、群集、蹭動能力的影響，并分析其影響是否與胰島素濃度存在劑量依賴性。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑 本實驗所需野生對照株PAO1、c-di-GMP 低表達株PAO1/Plac-yhjH、c-di-GMP 過表達株PAO1/ΔwspF 由新加坡南洋理工大學生命科學學院惠贈。中效胰島素：精蛋白鋅重組人胰島素注射液（優(yōu)泌林N 中效型3ml：300 單位筆芯/禮來蘇州制藥有限公司），熱變性優(yōu)泌林N；ABTGC 培養(yǎng)液（基），主要成分：硫胺素注射液（國產(chǎn)）、硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、三氯化鐵、瓊脂粉、葡萄糖，均為國產(chǎn)分析純；四環(huán)素粉（批號：T04422-10G）、酪蛋白氨基酸，LB 培養(yǎng)基、LB 肉湯。

1.2 檢測泳動能力 將三種菌株復蘇后，接種到裝有3ml LB 培養(yǎng)液的12ml 培養(yǎng)管中，置于37℃恒溫箱，轉速250r/min，連續(xù)過夜培養(yǎng)16h；次日清晨，離心，4℃，3 000r/min，15min，沉淀物用ABTGC 培養(yǎng)液洗滌2 次，用ABTGC 培養(yǎng)液將菌懸液濃度調到光密度值OD600=0.1（～108CFU/ml），再用ABTGC 培養(yǎng)液10 倍系列稀釋100 倍(以下同)。取菌液2μl針刺接種于不同濃度胰島素的瓊脂含量為0.3%的ABTGC 培養(yǎng)基表面的中央，置于37℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)24h，用尺子測量細菌在不同方向上的泳動運動菌落的直徑。

1.3 檢測群集能力 取菌液2μl 針刺接種于不同濃度胰島素的瓊脂含量為0.5%的ABTGC 培養(yǎng)基中央的里面，置于37℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)24h，用尺子測量細菌在不同方向上群集運動菌落的直徑。

1.4 檢測蹭動能力 取菌液2μl 針刺接種于不同濃度胰島素的瓊脂含量為1%的ABTGC 培養(yǎng)基中央表面穿透到達底部，置于37℃恒溫箱靜止培養(yǎng)24h，去除瓊脂培養(yǎng)基，室溫干燥，用0.1%結晶紫溶液2ml，對培養(yǎng)皿底部進行染色20min，倒掉染液，取滅菌生理鹽水洗培養(yǎng)皿2min，室溫干燥，尺子測量培養(yǎng)皿底部著色范圍的直徑大小。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0 軟件包分析，每組至少復盤3 次，重復3 次，取平均值，以±s±s 表示，組間均數(shù)符合正態(tài)分布者比較采用ANOVA 分析，組間比較采用LSD 檢驗，k-1 組與對照組比較采用Dunnett Text，不符合正態(tài)分布者采用秩和檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 c-di-GMP 抑制銅綠假單胞菌的泳動、群集、蹭動能力

2.1.1 泳動能力 PAO1、PAO1/Plac-yhjH、PAO1/ΔwspF三組菌株均以接種點為中心形成霧狀同心圓樣區(qū)域，PAO1/Plac-yhjH 泳動直徑較對照PAO1 組稍大，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而PAO1/ΔwspF 組泳動直徑較對照PAO1 組顯著變小，僅為對照組泳動直徑的1/5，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與對照PAO1 組泳動能力相比，PAO1/Plac-yhjH 組泳動能力稍增強，而PAO1/ΔwspF 組則明顯被抑制，見表1。實驗結果表明c-di-GMP 可以抑制PA 的泳動能力。

2.1.2 群集能力 PAO1/Plac-yhjH 組菌落呈分支狀，其區(qū)域直徑大于對照PAO1 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）； 而PAO1/ΔwspF 組周圍光滑，無偽足樣放射，且區(qū)域直徑明顯小于PAO1 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1、表1。實驗表明c-di-GMP 可抑制PA 的群集能力。

2.1.3 蹭動能力 PAO1、PAO1/Plac-yhjH、PAO1/ΔwspF三組菌株均以接種點為中心形成同心圓樣區(qū)域，測量培養(yǎng)皿底部著色范圍直徑大小。PAO1/PlacyhjH 組菌落直徑大于對照PAO1 組，表明PAO1/Plac-yhjH 組蹭動能力較對照PAO1 組強，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而PAO1/ΔwspF 組同心圓區(qū)域直徑小于對照PAO1 組，其蹭動直徑僅為對照組的1/3，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明PAO1/ΔwspF 組菌落的蹭動能力明顯被抑制，見表1。結果表明c-di-GMP 可抑制PA 的蹭動能力。

表1 c-di-GMP 表達不同的菌株運動能力比較

圖1 c-di-GMP 表達不同的菌株運動能力比較

2.2 胰島素抑制PA 野生菌株及胞內c-di-GMP 低表達菌株的泳動、群集、蹭動能力

2.2.1 胰島素抑制PA 野生菌株及胞內c-di-GMP 低表達菌株的泳動能力 在野生PAO1、胞內c-di-GMP 低表達PAO1/Plac-yhjH 菌株中，與熱變性胰島素對照組相比，含有不同濃度胰島素組的泳動直徑明顯變小，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且在三個濃度之間菌株的泳動能力無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。而在胞內c-di-GMP 過 表達PAO1/ΔwspF 菌株中，各組之間泳動直徑大小變化不大，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。表明胰島素能抑制PA 野生菌株及細胞內c-di-GMP 低表達菌株的泳動能力，而對PA 細胞內c-di-GMP 過表達菌株的泳動能力無影響。

2.2.2 胰島素抑制PA 野生菌株及細胞內c-di-GMP低表達菌株的群集能力 在野生PAO1、胞內c-di-GMP 低表達PAO1/Plac-yhjH 菌株中，與熱變性胰島素對照組相比，含有不同濃度胰島素組的群集直徑明顯變小，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且在三個濃度之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表2。在胞內c-di-GMP 過表達PAO1/ΔwspF 菌株中，各組之間群集直徑大小變化不大，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明胰島素能抑制PA 野生菌株及細胞內c-di-GMP 低表達菌株的群集能力，而對PA 細胞內c-di-GMP 過表達菌株的群集能力無影響。

2.2.3 胰島素對PA 野生菌株、胞內c-di-GMP 低表達菌株、胞內c-di-GMP 過表達菌株的蹭動能力無影響 在野生PAO1、胞內c-di-GMP 低表達PAO1/Plac-yhjH、胞內c-di-GMP 過表達PAO1/ΔwspF 菌株中，胰島素對照組及含有200mU/ml、200μU/ml、200nU/ml 組之間的蹭動直徑大小變化不大，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗結果表明，胰島素未能影響PA 野生菌株、胞內c-di-GMP 低表達菌株、胞內c-di-GMP 過表達菌株的群集能力。

表2 胰島素對胞內c-di-GMP 不同表達量PA 泳動、群集、蹭動能力的影響（mm，±s）

表2 胰島素對胞內c-di-GMP 不同表達量PA 泳動、群集、蹭動能力的影響（mm，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

菌株 胰島素濃度 泳動運動 群集運動 蹭動運動PAO1 熱變性胰島素 13.25±1.90 5.29±0.28 10.96±0.39 200nU/ml 7.50±1.38** 4.25±0.22** 11.25±0.72 200μU/ml 6.43±2.43** 4.21±0.21** 10.79±0.88 200mU/ml 5.75±0.63*** 3.79±0.20** 11.00±1.26 PAO1/ 熱變性胰島素 14.42±2.67 6.96±0.79 11.83±0.90 Plac-yhjH 200nU/ml 9.21±1.72* 4.92±0.59* 10.50±0.81 200μU/ml 8.70±1.98* 4.79±0.85* 12.25±0.23 200mU/ml 6.29±0.64** 3.75±0.35** 11.71±0.23 PAO1/ 熱變性胰島素 2.13±0.27 2.42±0.16 3.57±0.30 ΔwspF 200nU/ml 2.38±0.38 2.46±0.24 3.67±0.49 200μU/ml 2.00±0.23 2.67±0.22 3.96±0.58 200mU/ml 2.04±0.17 2.63±0.27 3.44±0.36

3 討論

PA 廣泛分布在自然界中，各種水、土壤、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和消化道等均有該菌的存在。PA 是一種條件致病菌，是醫(yī)院感染最常見的革蘭氏陰性菌之一，它能適應各種環(huán)境并形成生物膜，而該生物膜的形成則使醫(yī)院感染具有難治性和反復發(fā)作性的特點。細菌的黏附是形成生物膜引起感染的初始階段，細菌黏附于醫(yī)療植入物，通過分泌胞外多糖等物質將其包繞其中形成具有三維結構的聚集體，即為生物膜，生物膜的形成使臨床上的感染遷延不愈。因此，抑制細菌的黏附也是控制細菌生物膜感染的重要環(huán)節(jié)之一。PA 的黏附力與鞭毛、菌毛及其自身運動-泳動、群集和蹭動有著密切的關系。細菌群集不僅是一種運動形式，而且代表了其復雜的適應性，導致毒力基因表達和抗生素抗性的變化。

c-di-GMP 是細胞內第二信使，其控制許多細菌的生物膜生命周期。就PA 而言，胞內高c-di-GMP 含量通過降低運動性和生物膜基質的產(chǎn)生來增強生物膜形成，而胞內c-di-GMP 含量降低導致運動性增強和生物膜分散[5]，因此，c-di-GMP 信號通路可以調控細菌的運動能力[6]。PA 的鞭毛和菌毛、群集和蹭動運動等被視為急性毒力表型，生物膜被視為慢性毒力表型；而這些毒力表型都受c-di-GMP 信號通路的調節(jié)[3，6]。糖尿病患者容易并發(fā)各種感染[1]，而PA 是在糖尿病足表面感染的組織中培養(yǎng)出的最常見的革蘭氏陰性菌[2]。2017 中國糖尿病足診治指南指出糖尿病足的內科診治中控制血糖首選胰島素[7]，而胰島素對胞內c-di-GMP 不同表達的PA 運動能力的影響機制尚未闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)在未使用胰島素干預下，與對照株PAO1 相比，c-di-GMP 低表達株PAO1/Plac-yhjH的運動能力影響不明顯，而c-di-GMP 過表達株 PAO1/ΔwspF 的泳動、群集、蹭動能力都明顯被抑制。在本研究的預實驗中，我們先將胰島素進行變性，生理鹽水為空白對照組，發(fā)現(xiàn)變性胰島素組和空白組比較，對c-di-GMP 濃度不同的PA 運動能力的影響不顯著。因此，之后進行實驗時所用到的變性胰島素均指直接變性后的胰島素原液。胰島素可抑制對照菌株PAO1 和c-di-GMP 低表達菌株PAO1/Plac-yhjH 泳動能力和群集能力，且其效應與胰島素劑量無依賴性，但胰島素對胞內c-di-GMP過表達菌株PAO1/ΔwspF 的泳動、群集能力均無影響。此外，胰島素不影響PA 野生菌株、胞內c-di-GMP 低表達菌株、胞內c-di-GMP 過表達菌株的蹭動能力。

研究報道胞內過表達c-di-GMP 的PA 菌株能刺激表多糖產(chǎn)生,從而增加細菌表面粘附性，使菌株的運動能力下降；相反，胞內低表達c-di-GMP 的PA 菌株則可刺激細菌運動性[8]。本研究也驗證了這一結論，在未使用胰島素干預下，c-di-GMP 過表達株PAO1/ΔwspF 組運動能力明顯被抑制，其機制可能是過表達的c-di-GMP 刺激表多糖產(chǎn)生,增加細菌細胞表面粘附性，致使菌株的運動能力下降。Watters 等[9]報道胰島素加快PA 在體外的生物膜形成，從而顯著延緩糖尿病患者傷口的愈合[10]。相反，也有研究報道低劑量胰島素能改善宿主對銅綠假單胞菌感染的抵抗力[11]。本研究發(fā)現(xiàn)胰島素可抑制野生菌株PAO1 以及細胞內c-di-GMP 低表達菌株PAO1/Plac-yhjH 的泳動運動、群集運動能力，且其效應與胰島素劑量無依賴性，而胰島素對c-di-GMP 過表達株 PAO1/ΔwspF 三種運動能力均無影響，考慮其原因可能是c-di-GMP 過表達對菌株運動能力的抑制效應明顯大于胰島素的抑制效應，相關機制有待于進一步探討。

綜上所述，胰島素抑制野生株PAO1 和c-di-GMP 低表達株PAO1/Plac-yhjH 泳動能力和群集能力，且其效應與胰島素劑量無依賴性，而對三種菌株的蹭動能力均無影響。本研究為進一步分析糖尿病鼠模型中生物膜形成提供理論依據(jù)。