錢敏艷 王曉芳

摘要 敘述了普通高中應(yīng)如何開展植物組培實(shí)驗(yàn)的建設(shè)和課程開發(fā)以及組織培養(yǎng)過程中的一些成功的經(jīng)驗(yàn)和不足之處的反思。

關(guān)鍵詞 植物組織培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)室建設(shè) 課程實(shí)踐

中圖分類號(hào) G633.91

文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

1新課標(biāo)對(duì)植物組織培養(yǎng)技術(shù)的要求

《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》（以下簡(jiǎn)稱新課標(biāo)）的基本理念強(qiáng)調(diào)以核心素養(yǎng)為宗旨，教學(xué)過程重實(shí)踐，在教學(xué)過程中要讓學(xué)生主動(dòng)參與學(xué)習(xí)過程，多動(dòng)手動(dòng)腦，加深對(duì)生物學(xué)概念的理解，進(jìn)而提升應(yīng)用知識(shí)的能力。在新的高中生物學(xué)課程結(jié)構(gòu)中，選擇性必修模塊《生物技術(shù)與工程》以及選修模塊“學(xué)業(yè)發(fā)展基礎(chǔ)”都要求學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)技術(shù)。選擇性必修模塊《生物技術(shù)與工程》的內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)中要求學(xué)生闡明植物組織培養(yǎng)是在一定條件下，將離體植物器官、組織和細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織，并重新分化，最終形成完整植株的過程。新課標(biāo)認(rèn)為植物組織培養(yǎng)室不需要昂貴的儀器設(shè)備和藥品，投資少，可以在短時(shí)間內(nèi)不受自然條件限制培育出大量具有優(yōu)良性狀的幼苗。在新課標(biāo)下，建設(shè)一個(gè)適合學(xué)生使用的植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室將成為必然。

2植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的改建與設(shè)備購(gòu)置

作為一般的普通高中，建設(shè)一個(gè)與大學(xué)實(shí)驗(yàn)室條件相當(dāng)?shù)闹参锝M織培養(yǎng)室需要30萬(wàn)左右的資金，實(shí)現(xiàn)的可能性較小。我校的自然科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心雖為江蘇省課程基地項(xiàng)目，但由于是數(shù)理化生共建的項(xiàng)目，所以經(jīng)費(fèi)也并不是太充裕。為了既能適應(yīng)新課程標(biāo)準(zhǔn)對(duì)教學(xué)的要求，又能在力所能及的范圍內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)室改造，我校對(duì)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了如下的建設(shè)，總體的費(fèi)用約10萬(wàn)。

2.1實(shí)驗(yàn)室的改建

通過對(duì)高校和一些中學(xué)生物課程基地校植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的參觀學(xué)習(xí)，以及與生物技術(shù)公司的交流，選擇了一間光線良好、長(zhǎng)12m、寬8m的普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行改造。為了滿足植物組織培養(yǎng)室的各種條件，把實(shí)驗(yàn)室分成了更衣室、無(wú)菌室、培養(yǎng)室、煉苗室、教學(xué)區(qū)等區(qū)域。

2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備的購(gòu)置

植物組織培養(yǎng)過程中對(duì)無(wú)菌的要求很高，我校在改建中為了節(jié)省成本，沒有建風(fēng)淋室。為了保證實(shí)驗(yàn)效果，購(gòu)置了紫外滅菌燈放在無(wú)菌室，用于實(shí)驗(yàn)前的環(huán)境消毒。除此之外，高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、接種器具殺菌器、組培接種服等都是滿足無(wú)菌條件的重要保障。決定組織培養(yǎng)能夠成功的另一重要因素是培養(yǎng)基，教師可以根據(jù)教材上的培養(yǎng)基配方自己配制，也可以直接從生物技術(shù)公司購(gòu)買MS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基中的各種元素比例要求嚴(yán)格，如果直接拿自來水來配制也會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗，因此需要用純水器來制備超純水。接種后的無(wú)菌苗必須置于潔凈度高、光照充足、溫濕度適宜的環(huán)境。智能光照培養(yǎng)箱能夠滿足以上要求，它與光照培養(yǎng)架的不同在于可以提供恒定的溫度，具有溫度、光照度程序設(shè)定功能，能夠滿足實(shí)驗(yàn)的要求。具體設(shè)備購(gòu)置情況見表1，如果實(shí)驗(yàn)室建設(shè)經(jīng)費(fèi)有限，其中的移液器、電熱鼓風(fēng)干燥箱可以暫不購(gòu)置。

3課程開發(fā)

3.1課程說明

植物組織培養(yǎng)是基于植物細(xì)胞具有全能性這一理論，近幾十年發(fā)展起來的一項(xiàng)植物體無(wú)性繁殖的新技術(shù)。通過本課程的學(xué)習(xí)，學(xué)生將掌握植物組織培養(yǎng)基制備、外植體接種、繼代培養(yǎng)、移栽等相關(guān)知識(shí)和技能，初步具備植物組織培養(yǎng)的職業(yè)素養(yǎng)，為今后大學(xué)專業(yè)選擇提供指導(dǎo)，奠定基礎(chǔ)。本課程的成績(jī)?cè)u(píng)定將由以下三部分組成：

1學(xué)生的課堂表現(xiàn)占20%，包括出勤率、課堂參與程度;2實(shí)驗(yàn)過程的規(guī)范性和實(shí)驗(yàn)成功率占50%;3學(xué)習(xí)撰寫相應(yīng)的小論文占30%。

3.2課程目標(biāo)

1通過本課程的學(xué)習(xí)，能說出植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常用的儀器、設(shè)備及用具的使用方法;明確植物組織培養(yǎng)工作的程序，說出無(wú)菌操作的原則;掌握培養(yǎng)基配制與滅菌、接種、培養(yǎng)及組培苗馴化移栽的方法;能分析實(shí)驗(yàn)操作過程中成敗的原因。

2通過本課程的學(xué)習(xí)，能正確使用并維護(hù)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的儀器與設(shè)備;熟悉植物組織培養(yǎng)技術(shù)的程序，遵循無(wú)菌操作原則進(jìn)行培養(yǎng)基的配制與滅菌、接種、培養(yǎng)及組培苗馴化移栽;能夠按照培養(yǎng)對(duì)象正確選擇有效的培養(yǎng)基，正確調(diào)控培養(yǎng)條件;成功培養(yǎng)一些植物器官。

3.3課程內(nèi)容設(shè)計(jì)

從植物組織培養(yǎng)課程選題，將植物組織培養(yǎng)技術(shù)所需要的知識(shí)和技能進(jìn)行整合和簡(jiǎn)化，使之適合我?，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件和高中學(xué)生能接受的程度，形成植物組織培養(yǎng)課程教學(xué)的兩個(gè)課程單元，共整合為8個(gè)主題：?jiǎn)卧弧爸参锝M織培養(yǎng)基本操作技術(shù)”;單元二“植物組織培養(yǎng)實(shí)際應(yīng)用技術(shù)”。這些主題覆蓋了植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作的全部過程，具體教學(xué)內(nèi)容與學(xué)時(shí)分配如下。

單元一“植物組織培養(yǎng)基本操作技術(shù)”包括：

1植物組織培養(yǎng)的基本認(rèn)識(shí)（共2個(gè)課時(shí)）——植物組織培養(yǎng)的概念、植物細(xì)胞的全能性、脫分化與再分化;

2植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及設(shè)備使用（共2個(gè)課時(shí)）——植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置、常用設(shè)備儀器及使用、常用器皿的洗滌;

3培養(yǎng)基配制（共2個(gè)課時(shí)）——培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)要求和環(huán)境要求、培養(yǎng)基的基本類型、母液的配制方法與培養(yǎng)基的配制;

4外植體接種（共2個(gè)課時(shí)）——如何選擇外植體、外植體的表面滅菌、常用的表面滅菌劑、外植體接種。

單元二“植物組織培養(yǎng)實(shí)際應(yīng)用技術(shù)”包括：

1矮牽牛莖尖組織培養(yǎng)（共2個(gè)課時(shí)）;

2煙草不定芽誘導(dǎo)及完整植株形成（共2個(gè)課時(shí)）;

3菊花莖尖與花瓣組織培養(yǎng)（共2個(gè)課時(shí)）;

4石斛植物離體快繁（共1個(gè)課時(shí)）。

學(xué)生實(shí)踐參觀，整理實(shí)驗(yàn)報(bào)告，整理小論文（2個(gè)課時(shí)）。另有1個(gè)課時(shí)作為機(jī)動(dòng)安排。

3.4實(shí)驗(yàn)操作評(píng)價(jià)

在上述8個(gè)主題的教學(xué)活動(dòng)中，每個(gè)學(xué)習(xí)小組必須完成四個(gè)方面的操作內(nèi)容作為實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)的依據(jù)，包括：

（1）每組學(xué)生每人能獨(dú)立完成組培室的無(wú)菌操作，減少組培苗的雜菌感染率;

（2）每組分別配制大量元素母液1000mL、微量元素母液1000mL、鐵鹽母液1000mL、有機(jī)物母液500mL;

（3）選擇1或2種外植體進(jìn)行預(yù)處理，并完成外植體表面滅菌的任務(wù);

（4）每組完成根、莖、葉外植體各20瓶培養(yǎng)基接種任務(wù)。

4植物組織培養(yǎng)實(shí)踐——以矮牽牛為例

4.1培養(yǎng)基的配制

取出母液和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液并按順序放好。將潔凈的各種器皿，如量筒、燒杯、移液管、移液槍和玻璃棒等放在合適位置。取一只1L燒杯，放入約500mL蒸餾水，依次加入大量元素母液1（100mL）、微量元素母液2（10mL）、鐵鹽母液3（10mL）和有機(jī)物質(zhì)母液4（5mL），并不斷攪拌。加入瓊脂（通常5.0～7.0g/L），加熱使其完全溶解。加入30g蔗糖，待蔗糖溶解后加蒸餾水定容至1L。調(diào)整pH至5.6～5.8，用預(yù)先配好的氫氧化鈉或鹽酸進(jìn)行調(diào)節(jié)。

4.2培養(yǎng)基的分裝、滅菌

將1000mL培養(yǎng)基分裝進(jìn)滅菌后的20個(gè)小型培養(yǎng)瓶，每瓶約50mL培養(yǎng)基。將分裝過后的培養(yǎng)瓶再次用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20min，滅菌后待高壓鍋壓力下降到0Pa時(shí)取出，待培養(yǎng)基溫度降至40～50°C時(shí)，在超凈工作臺(tái)上加入過濾除菌的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，50mL培養(yǎng)基加0.1mL的NAA和0.1mL的6-BA，用移液槍取樣，充分混合后靜置凝固后再用。實(shí)驗(yàn)過程中需要用的無(wú)菌水、接種盤等可同時(shí)高壓滅菌。

4.3對(duì)無(wú)菌接種間滅菌

每次接種操作前提前3h打開接種間的紫外燈消毒，把整個(gè)實(shí)驗(yàn)所需用到的實(shí)驗(yàn)材料和器材放到超凈工作臺(tái)內(nèi)用紫外燈再滅菌數(shù)小時(shí)。超凈工作臺(tái)中放有接種器械滅菌器，實(shí)驗(yàn)過程中需要用到的鑷子、剪刀等用具插入接種器具滅菌器（300°C）中滅菌。

4.4實(shí)驗(yàn)操作者的消毒

操作者進(jìn)入接種室前，要在準(zhǔn)備室內(nèi)用溫水和肥皂清洗雙手并擦干，指甲縫內(nèi)要用酒精特別消毒，不允許留長(zhǎng)指甲。進(jìn)入接種間前換上消毒好的接種服，在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行接種操作之前，用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精擦拭雙手。

4.5外植體的獲取和接種

從已有的組培苗中剪取外植體，可以盡可能避免雜菌污染。植株不同部位的組織、器官中生理狀態(tài)有很大不同，對(duì)培養(yǎng)基的反應(yīng)也不同，因此選擇合適的外植體對(duì)于實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒苤匾?。外植體可分為帶芽的外植體和分化組織構(gòu)成的外植體，如帶有側(cè)芽的莖尖就是帶芽外植體。對(duì)于大多數(shù)植物來說，莖尖無(wú)疑是較好的取材部位，因?yàn)槠湫螒B(tài)已基本形成，生長(zhǎng)速度快，莖段側(cè)芽或頂芽容易萌發(fā)。打開已有組培苗的培養(yǎng)瓶，取出矮牽牛小苗于接種盤中，用消毒并冷卻的剪刀和鑷子剪取矮牽牛莖尖的莖段，打開裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，插入莖段并迅速蓋上瓶蓋，插入時(shí)注意莖段的方向，不要倒插。此過程中，如果是教師操作，可在酒精燈周圍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，接種完成后培養(yǎng)瓶口和瓶蓋在火焰上過幾圈可以更好地防止雜菌污染。如果是學(xué)生操作，可以不使用酒精燈，以免操作臺(tái)內(nèi)物品太多造成危險(xiǎn)。使用過的器械可用無(wú)菌水沖洗后重新插入高溫滅菌器滅菌，進(jìn)行下一次操作。

4.6接種后外植體的培養(yǎng)、觀察

待同一批接種完畢后，取出培養(yǎng)瓶并貼上標(biāo)簽，標(biāo)注接種材料和日期，然后放入智能光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。溫度設(shè)置為25°C，光照、黑暗各12h交替進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)記錄顯示3月7日接種15瓶矮牽牛，一星期后就有部分外植體長(zhǎng)出了新芽，有兩瓶發(fā)生了雜菌污染，其余長(zhǎng)勢(shì)良好.兩周后，取出培養(yǎng)瓶移入光照培養(yǎng)架。4月7日觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)有一瓶矮牽牛已開出紫色小花。

5實(shí)驗(yàn)過程中的經(jīng)驗(yàn)與反思

5.1成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

5.1.1取材的方法

按照植物的生長(zhǎng)規(guī)律，在春夏季節(jié)取材，材料幼嫩，細(xì)胞分裂旺盛，室外氣溫適宜，組織培養(yǎng)容易取得成功;反之，秋冬季節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)成功概率相對(duì)較低。

5.1.2培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基配制的過程中，水浴加熱時(shí)間太長(zhǎng)，影響學(xué)生實(shí)驗(yàn)過程，所以可用700W微波爐高火加熱7min，效果與水浴加熱相同。高壓滅菌時(shí)，玻璃培養(yǎng)瓶可滅菌25min，塑料培養(yǎng)瓶滅菌20min，滅菌時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致瓊脂變質(zhì)、不易凝固。滅菌結(jié)束后應(yīng)立即把培養(yǎng)基取出放入超凈工作臺(tái)冷卻，因?yàn)槿绻诟邏簻缇佒欣鋮s，由于余溫仍很高，培養(yǎng)基會(huì)變黃。

5.1.3超凈工作臺(tái)的使用

超凈工作臺(tái)在接種前關(guān)掉紫外燈，工作臺(tái)拉門打開少許，等待2min，待臭氧氣體排出后再進(jìn)行操作，同時(shí)打開照明燈，風(fēng)扇速度調(diào)至慢速。實(shí)驗(yàn)操作者雙手伸入超凈工作臺(tái)，盡可能不要有著有衣物部分進(jìn)入，雙手及手腕處多用酒精棉球擦拭幾遍。超凈臺(tái)中接種器械滅菌器內(nèi)鑷子溫度很高，使用時(shí)需先取出冷卻或沒入無(wú)菌水冷卻，避免燙傷外植體。

5.2困難與反思

我校改造的無(wú)菌室可放置3-4臺(tái)超凈工作臺(tái)，可容納的學(xué)生人數(shù)少。每次教學(xué)活動(dòng)時(shí)，學(xué)生只能分批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。學(xué)生操作培養(yǎng)的試管苗被污染率要明顯高于教師培養(yǎng)的試管苗，說明學(xué)生進(jìn)行操作時(shí)消毒跟滅菌過程中還不夠徹底。目前成功接種了大量的矮牽牛、菊花、煙草苗，均是以莖尖為實(shí)驗(yàn)材料直接培養(yǎng)出了根和芽，而沒見到愈傷組織。如需觀察愈傷組織，則在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上還需添加等量的0.2mg/mL的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素，并進(jìn)行暗培養(yǎng)，這還需進(jìn)行進(jìn)一步的探究。