張烽，殷俊，傅文凡，戴璐，潘雷，鐘圣鵬，趙健

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣州510095)

隨著人口增長(zhǎng)及老齡化的雙重作用，肺癌已成為我國(guó)惡性腫瘤死亡的首要原因。由于缺乏針對(duì)肺癌的早期篩查及診斷的特異性生物學(xué)標(biāo)志，且肺癌早期并無(wú)明顯臨床癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已是中晚期，預(yù)后極差，5年生存率低于10%[1]。尋找新的肺癌發(fā)生標(biāo)志物、研發(fā)更多靶向藥物對(duì)肺癌的診治具有重要意義。錨蛋白重復(fù)序列(ANKRD)是自然界中存在于真核、原核及病毒中的一種蛋白質(zhì)序列模體，其家族成員數(shù)量眾多，參與生物體的各種生理過程，如細(xì)胞骨架完整性、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、發(fā)育和分化、細(xì)胞凋亡、囊泡運(yùn)輸、炎癥反應(yīng)、植物抗性和細(xì)菌侵襲等[2，3]，并存在于從病毒到人類的大多數(shù)物種中[4]。在前期研究中，我們通過基因芯片檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的腫瘤組織和癌旁組織，發(fā)現(xiàn)ANKRD22在腫瘤組織中表達(dá)明顯增高，提示其可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5]，但ANKRD22在NSCLC發(fā)病過程中的作用尚不明確。2017年5月～2018年5月，我們通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)人NSCLC細(xì)胞株H1975中ANKRD22的表達(dá)，并通過一系列的細(xì)胞功能試驗(yàn)，探討ANKRD22對(duì)NSCLC細(xì)胞的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人NSCLC細(xì)胞株H1975，由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所保存。ANKRD22-siRNA質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。RPMI1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及0.25%胰蛋白酶消化液(美國(guó)Corning公司)，噻唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Sigma公司)，TRIzol(美國(guó)Life公司)，QuantScript RT Kit及Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green，北京天根生化科技有限公司)，Lipofectamine 2000 Reagent(美國(guó)Invitrogen公司)，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱(德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，普通PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)，7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTEK公司)，F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞加入含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合約90%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按2×105/孔接種于6孔板(內(nèi)含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基)。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和siRNA干擾組。siRNA干擾組和陰性對(duì)照組按照Lipofectamine 2000 Reagen說明分別轉(zhuǎn)染ANKRD22-siRNA質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒，空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞中ANKRD22表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR法。使用TRIzol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共20 μL：10 μL SYBR Green PCRMaster Mix，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，無(wú)核酶水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。使用StepOneTM軟件在72 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)，并進(jìn)行熔解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算ANKRD22的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1.3方法進(jìn)行分組、轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，按1×103/孔接種于96孔板(內(nèi)含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基)，每孔加入200 μL，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72、96、120 h加5 g/L MTT溶液20 μL孵育4 h，吸出孔內(nèi)液體，加入DMSO 150 μL，震蕩混勻10 min，上酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度(A)值，以A570值表示細(xì)胞增殖能力。

1.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1.3方法分組、轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，去上清；PBS洗滌，再次離心、去上清。加入結(jié)合緩沖液100 μL重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD混勻，室溫避光孵育15 min。加入結(jié)合緩沖液400 μL重懸細(xì)胞。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞周期檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1.3方法進(jìn)行分組、轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，去上清；PBS洗滌，再次離心、去上清。加入1 mL DNA染色液，渦旋震蕩5～10 s混勻。室溫避光孵育30 min。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各周期細(xì)胞所占比例。

2 結(jié)果

2.1 各組ANKRD22相對(duì)表達(dá)量比較 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA干擾組ANKRD22相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.000、0.931±0.065、0.312±0.047。siRNA干擾組ANKRD22相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P均<0.05)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組細(xì)胞增殖能力比較 siRNA干擾組培養(yǎng)24、48、72、96、120 h時(shí)，細(xì)胞增殖能力均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P均<0.05)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖能力比較

注：與空白對(duì)照組相同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組相同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA干擾組細(xì)胞凋亡率分別為30.53%±0.84%、31.42%±0.69%、40.71%±0.72%，siRNA干擾組細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P均<0.05)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組細(xì)胞周期比較 siRNA干擾組G0/G1期細(xì)胞比例高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，S期、G2/M期細(xì)胞比例低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P均<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組各周期細(xì)胞比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞周期比較

注：與空白對(duì)照組同期比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組同期比較，#P<0.05。

3 討論

ANKRD一般含有33或34個(gè)氨基酸殘基，依靠結(jié)構(gòu)區(qū)域的相互折疊在空間上形成螺旋環(huán)結(jié)構(gòu)，其主要功能是介導(dǎo)及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間的相互作用[6]。ANKRD能夠與多種配體相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的生物功能，其中一部分直接參與腫瘤的發(fā)生[7]。研究顯示，ANKRD蛋白家族與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。ANKRD1與卵巢癌的形成及化療藥物敏感相關(guān)[8]；ANKRD13能夠調(diào)控配體激活表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的快速內(nèi)化[9]；Ankrd17是細(xì)胞周期素(Cyclin) E/Cdk2的重要下游效應(yīng)物，能夠正向調(diào)節(jié)G1/S期細(xì)胞轉(zhuǎn)移[10]；ANKRD26是脂肪發(fā)生的新型重要調(diào)控因子，為調(diào)節(jié)脂肪發(fā)生提供了新的靶點(diǎn)[11]。Liu等[12]對(duì)肺癌患者的血清及痰液中的ANKRD18B基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ANKRD18B基因異常甲基化能夠影響肺癌的發(fā)生發(fā)展，DNA甲基化導(dǎo)致ANKRD18B基因表達(dá)失活，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，參與腫瘤的發(fā)生。Octavio等[13]報(bào)道，ANKRD22可能是胰腺癌的標(biāo)志物，其表達(dá)可反映腫瘤患者對(duì)免疫治療的不同療效。胰腺癌患者的血清和外周血單個(gè)核細(xì)胞中ANKRD22表達(dá)較正常人升高[13，14]，ANKRD22在外周血中的水平可作為胰腺導(dǎo)管腺癌的診斷指標(biāo)[15]。

腫瘤的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞惡性增殖有關(guān)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖是治療腫瘤的有效手段。本研究結(jié)果顯示，siRNA干擾組的細(xì)胞增殖能力低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖能力不斷下降。表明干擾ANKRD22表達(dá)可抑制H1975細(xì)胞增殖，可能成為潛在的抗肺癌細(xì)胞增殖的手段。

細(xì)胞凋亡是一種在基因控制下細(xì)胞主動(dòng)參與的“自殺”過程。正常細(xì)胞通過增殖和凋亡來維持自身穩(wěn)定，若凋亡信號(hào)下調(diào)，細(xì)胞可異常增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是抗腫瘤的一種重要機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，siRNA干擾組的細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，表明干擾ANKRD22表達(dá)能夠促進(jìn)H1975細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程，由Cyclin依次激活相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK)所推動(dòng)。Cyclin的周期性積累與分解對(duì)細(xì)胞周期起正調(diào)控作用,而細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子通過在細(xì)胞周期適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)上抑制CDK的活性，從而對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用。腫瘤共同的生物學(xué)特征是失控性生長(zhǎng)，其主要分子機(jī)制是細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致細(xì)胞增殖過多和凋亡過少。本研究發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾組細(xì)胞阻滯于G0/G1期，S期、G2/M期細(xì)胞比例均減少。這提示ANKRD22對(duì)腫瘤細(xì)胞周期有調(diào)節(jié)作用，干擾ANKRD22對(duì)細(xì)胞周期的影響可能是其抑制肺癌進(jìn)一步進(jìn)展的潛在機(jī)制。

綜上所述，抑制ANKRD22基因表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞周期，從而發(fā)揮抑癌作用。ANKRD22可能成為肺癌個(gè)性化治療的一個(gè)新方向。但本研究?jī)H是ANKRD22體外實(shí)驗(yàn)的初探，在人體內(nèi)抑制ANKRD22的表達(dá)能否能起到抑癌作用有待進(jìn)一步研究。