張蓉，宋占帥，鄒建芳

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250200；2山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院；3山東中醫(yī)藥大學(xué))

矽肺是以肺組織纖維化為主的疾病，目前的治療選擇十分有限。近年研究顯示，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是致肺組織纖維化關(guān)鍵性的細(xì)胞因子，而細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路介導(dǎo)的促增殖作用則是肺纖維化過程中必不可少的[1]。中醫(yī)學(xué)將矽肺歸為“咳嗽”“肺痿”“喘證”“肺痹”等范疇，認(rèn)為其病位在肺，病機(jī)為氣虛血瘀，故治療矽肺纖維化的基本原則為益氣活血。補(bǔ)陽還五湯出自王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，是益氣活血法的代表方劑。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯能夠抑制TGF-β1在肺內(nèi)的高表達(dá)，減輕肺纖維化程度[2]。2017年6～12月，我們通過制作大鼠矽肺模型，觀察補(bǔ)陽還五湯對肺泡炎癥和肺纖維化的影響，并以TGF-β1/ERK信號通路為靶點(diǎn)，探討補(bǔ)陽還五湯干預(yù)矽肺纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠120只，3～4月齡，體質(zhì)量(220±20)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)監(jiān)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周，大鼠在溫度20～24 ℃、相對濕度50%～60%、自然光照的動(dòng)物房中飼養(yǎng)。普通飼料喂養(yǎng)，飼料由山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠自由攝食、飲水。

1.1.2 藥品、試劑和儀器 將二氧化硅粉末高溫干燥后，用蒸餾水配制成濃度為50 mg/mL的混懸液。補(bǔ)陽還五湯由黃芪、赤芍、桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、地龍組成，藥物比例為5∶1∶1∶1∶1∶1∶1。濃縮藥液至含原藥材1 g/mL，滅菌，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?qiáng)的松(浙江仙琚制藥股份有限公司)，TGF-β1抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)，p-ERK、ERK1/2抗體(美國CST公司)，BCA蛋白測定試劑盒(美國PIERCE公司)。主要儀器為酶標(biāo)檢測儀、冷凍離心機(jī)、校準(zhǔn)型光密度儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與造模 將大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、補(bǔ)陽還五湯高劑量組、補(bǔ)陽還五湯中劑量組、補(bǔ)陽還五湯低劑量組，每組24只。模型組和補(bǔ)陽還五湯高、中、低劑量組采用一次性非暴露式二氧化硅氣管滴注法制作矽肺模型[3]。大鼠麻醉后，模型組及補(bǔ)陽還五湯不同劑量組氣管內(nèi)滴注1 mL二氧化硅混懸液，對照組氣管內(nèi)滴注1 mL生理鹽水。

1.2.2 給藥干預(yù)與標(biāo)本采集 造模成功后第2天，對照組和模型組均給予10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃，補(bǔ)陽還五湯高、中、低劑量組分別給予18.48、9.24、4.62 g/(kg·d)補(bǔ)陽還五湯灌胃，連續(xù)28 d。造模后7、14、28 d每組分別取8只大鼠，麻醉后仰臥固定，腹主動(dòng)脈放血，開胸，摘取右肺中、上葉100 mg，置于EP管中，液氮中保存。

1.2.3 肺組織病理學(xué)觀察 取肺組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，行HE染色和Masson染色，觀察組織病理學(xué)改變。根據(jù)文獻(xiàn)[4]方法評估肺泡炎和肺纖維化程度。肺泡炎：0分：無肺泡炎；1分：輕度肺泡炎，有局部病灶，肺組織病變范圍<20%，且有良好的肺泡結(jié)構(gòu)；2分：中度肺泡炎，肺組織病變范圍占20%～50%；3分：重度肺泡炎，彌漫性肺泡炎，肺組織病變范圍>50%。肺間質(zhì)纖維化程度：0分：無間質(zhì)纖維化；1分：輕度間質(zhì)纖維化，有局部病灶，肺組織病變范圍<20%；2分：中度間質(zhì)纖維化，肺組織病變范圍占20%～50%；3分：重度間質(zhì)纖維化，廣泛的間質(zhì)纖維化，肺組織病變范圍>50%，有大量實(shí)質(zhì)性損傷。

1.2.4 肺組織TGF-β1表達(dá)檢測 采用免疫組化SP法。取肺組織，加入4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片；二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，枸櫞酸鈉修復(fù)液微波100 ℃ 6 min、80 ℃ 6 min抗原修復(fù)；加入3% H2O2溶液37 ℃孵育30 min，PBS漂洗；加入山羊抗血清37 ℃封閉30 min；滴加TGF-β1抗體(濃度1∶800)，4 ℃過夜，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗;DAB顯色，封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。光鏡下陽性細(xì)胞呈棕黃色。采用雙盲法評分，每張切片觀察5個(gè)高倍視野。染色強(qiáng)度評分：無染色為0分、輕度染色為1分、中度染色為2分、高度染色為3分；染色細(xì)胞所占比例評分：無細(xì)胞染色為0分、<25%為1分、25%～50%為2分、>50%為3分。以兩項(xiàng)評分之和表示TGF-β1的表達(dá)水平。

1.2.5 肺組織p-ERK、ERK1/2表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取大鼠肺組織50 mg，剪碎勻漿，加入蛋白裂解液裂解，收集上清液，采用BCA定量蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測。取60 μg蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)組分后，轉(zhuǎn)印蛋白于醋酸纖維素膜上。將含p-ERK、ERK1/2抗體(1∶1 000稀釋)和β-actin(1∶1 000稀釋)抗體搖床孵育過夜，用TBST漂洗。將山羊抗兔IgG-HRP用TBST稀釋3 000倍，室溫下孵育30 min，TBST漂洗。ECL液顯影，X光膠片曝光后進(jìn)行顯影、定影。內(nèi)參蛋白為β-actin，以目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參的灰度值之比來定量分析各目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間肺組織肺泡炎評分、肺纖維化評分比較 與對照組相比，其他各組肺泡炎評分、肺纖維化評分在7、14、28 d時(shí)均升高(P均<0.01)；與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯各劑量組肺泡炎評分、肺纖維化評分均下降(P均<0.01)。見表1。

表1 各組不同時(shí)間肺組織肺泡炎評分、肺纖維化評分比較(分，

注：與對照組同期比較，*P<0.01；與模型組同期比較，#P<0.01。

2.2 各組不同時(shí)間肺組織TGF-β1表達(dá)比較 與對照組相比，其他各組TGF-β1表達(dá)均升高(P均<0.01)；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯各劑量組TGF-β1表達(dá)均降低(P均<0.01)。見表2。

表2 各組不同時(shí)間肺組織TGF-β1表達(dá)比較

注：與對照組同時(shí)間比較，*P<0.01；與模型組同時(shí)間比較，#P<0.01。

2.3 各組不同時(shí)間肺組織p-ERK、ERK1/2表達(dá)比較 與對照組相比，其他各組p-ERK、ERK1/2表達(dá)均增高(P<0.05或<0.01)；與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯各劑量組p-ERK、ERK1/2表達(dá)均降低(P<0.05或<0.01)。見表3。

3 討論

矽肺是由于在生產(chǎn)過程中長期吸入游離二氧化硅(石英)含量過高的粉塵而引起的以肺泡炎癥和肺組織纖維化為主的疾病[4，5]。目前我國不僅矽肺患病人數(shù)多，而且病情呈漸進(jìn)性加重，現(xiàn)已成為影響經(jīng)濟(jì)健康持續(xù)發(fā)展的重大公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。臨床上治療肺纖維化以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主，但這些免疫抑制劑抗纖維化效果有限，長期存活率差，并且會(huì)引起許多不良反應(yīng)[6]。因此，亟需尋求矽肺治療的新方法和新藥物。矽肺的發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡釋清楚。近年來中醫(yī)藥防治肺纖維化已成為抗矽肺纖維化的重點(diǎn)，中醫(yī)對該病的認(rèn)識與研究日趨成熟，在臨床和實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了很多對預(yù)防和治療肺纖維化有效的藥物。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)源遠(yuǎn)流長，認(rèn)為肺主氣，對于肺纖維化，歸屬于“肺痹”“肺萎”等病證范疇，因此益氣活血法為治療肺纖維化的基本方法。補(bǔ)陽還五湯為益氣活血的經(jīng)典代表方，出于清代名醫(yī)王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》一書，功效主要為補(bǔ)氣活血、祛瘀通絡(luò)。實(shí)驗(yàn)研究表明益氣養(yǎng)陰、活血化瘀中藥能夠抑制動(dòng)物模型肺纖維化膠原合成和沉積，從而發(fā)揮抗肺纖維化作用[7，8]。

表3 各組不同時(shí)間肺組織ERK1/2表達(dá)比較

注：與對照組同時(shí)間比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組同時(shí)間比較，#P<0.05，##P<0.01。

矽肺肺纖維化的發(fā)展包括肺泡炎癥反應(yīng)和纖維化形成兩個(gè)階段[9]。研究表明，急性肺泡炎是矽肺纖維化的早期病變基礎(chǔ)，在肺泡炎形成過程中涉及很多細(xì)胞因子[10]，肺泡炎評分一定程度反映了肺組織肺泡炎的程度。而肺纖維化評分則是一定程度上反應(yīng)肺組織間質(zhì)纖維化的水平。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，其他各組肺泡炎評分、肺纖維化評分在7、14、28 d時(shí)均升高；與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯各劑量組肺泡炎評分、肺纖維化評分均下降。本研究中病理結(jié)果量化評分顯示，矽肺纖維化早期肺泡炎程度較纖維化形成期更嚴(yán)重，補(bǔ)陽還五湯各劑量治療組與模型組相比，肺泡炎性浸潤減少，且肺泡炎及纖維化程度隨補(bǔ)陽還五湯劑量增加而減輕，表明補(bǔ)陽還五湯在減輕矽塵引起的肺損傷過程中具有抗炎抗纖維化作用。

TGF-β1是關(guān)鍵性的致矽肺纖維化的細(xì)胞因子，其主要作用是促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞過度增殖、分化，進(jìn)而促使膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)在肺泡間和肺間質(zhì)過度聚積，導(dǎo)致矽肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[11，12]。ERK通路是由TGF-β1介導(dǎo)的肺纖維化形成過程中重要的通路之一[13]。有研究顯示，ERK1/2在肺泡炎癥和纖維化階段均參與了肺纖維化的發(fā)病過程[14]。國內(nèi)外研究表明，在二氧化硅、石棉等所致肺纖維化的模型中均有ERK表達(dá)增加[15]。進(jìn)一步證明ERK信號通路參與了肺纖維化病變的發(fā)生。目前，對于細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的研究是矽肺纖維化的研究重點(diǎn)[16]。我們以大鼠矽肺纖維化模型為載體，觀察補(bǔ)陽還五湯對TGF-β1/ERK信號通路相關(guān)蛋白TGF-β1、ERK1/2、p-ERK表達(dá)的影響。與對照組相比較，同期模型組中TGF-β1、ERK1/2及p-ERK的表達(dá)顯著增高,尤其中后期高表達(dá)情況異常突出。與模型組相比較，各給藥組中同期TGF-β1、ERK1/2、p-ERK的表達(dá)均有下降。表明補(bǔ)陽還五湯可通過抑制TGF-β1、ERK1/2及p-ERK的高表達(dá)，而抑制矽肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,補(bǔ)陽還五湯可以有效降低肺泡炎及肺纖維化評分，并能抑制矽肺肺組織中TGF-β1、ERK1/2及p-ERK的表達(dá)上調(diào)，提示補(bǔ)陽還五湯能夠較好的調(diào)控TGF-β1/ERK信號通路，進(jìn)而抑制其產(chǎn)生的促增殖作用，進(jìn)而抑制矽肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。