王翔宇，于曉清，丁 剛，宋愛(ài)環(huán)，劉洪軍

(山東省海洋生物研究院，山東 青島 266104)

0 引言

海帶是一種具有異型世代交替的大型褐藻，具有微小的配子體世代和大型的孢子體世代，自然分布于朝鮮北部沿海，日本本州北部、北海道，以及俄羅斯南部沿海[1]。我國(guó)以前沒(méi)有自然生長(zhǎng)的海帶，20世紀(jì)50年代以來(lái)，經(jīng)過(guò)我國(guó)科研人員的不懈努力，建立了海帶的規(guī)?；绾宛B(yǎng)殖技術(shù)，并創(chuàng)制了一系列優(yōu)良種質(zhì)[2]。在海帶種質(zhì)的保存方式上，低溫弱光保存配子體是公認(rèn)的長(zhǎng)期保存海帶種質(zhì)的最佳方式[3]，且目前我國(guó)的海帶種質(zhì)絕大多數(shù)是以這種方式保存的。通過(guò)這種保存方式，有的海帶種質(zhì)可保存長(zhǎng)達(dá)二十幾年[4]。作者在長(zhǎng)期從事海帶種質(zhì)保存的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，有些保存的海帶配子體的顏色會(huì)變淺或者呈現(xiàn)白色，推測(cè)引起顏色變化的原因是細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但還未見(jiàn)此類研究的報(bào)道?；诖?，作者觀察了不同顏色的海帶雌配子體細(xì)胞的顯微和超微結(jié)構(gòu)，以期為海帶種質(zhì)長(zhǎng)期健康保存提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海帶雌配子克隆體取自山東省海洋生物研究院藻類種質(zhì)庫(kù)。采集時(shí)間是2002年8月。保存條件：4 ℃，光源是熒光燈管，光照強(qiáng)度為6～9 μmol/(m2·s)，光照時(shí)間為8 h，每3個(gè)月更換1/3的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液是經(jīng)過(guò)過(guò)濾后煮沸消毒的海水，添加有285.7 μmol/L N-NaNO3(AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，12.9 μmol/L P-KH2PO4(AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取少量肉眼可見(jiàn)已變淺褐色和完全發(fā)白的海帶配子體克隆絲狀體，用勻漿機(jī)(FSH-2A，金壇市醫(yī)療儀器廠)2000 r/min粉碎30 s，然后置于1.5 mL離心管中，用離心機(jī)(MIKRO-120，Hettich，Germany)2000 r/min離心30 s，去掉上清液便得到長(zhǎng)度較短的配子體片段濃縮液。

1.2.1 顯微觀察

取少量配子體置于玻片上，滴1滴低溫滅菌海水。用生物顯微鏡(YS100，Nikon，Japan)40×目鏡觀察，并對(duì)配子體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)行拍照。

1.2.2 超微觀察

取各種狀態(tài)的配子體，用4%戊二醛和1%鋨酸(體積分?jǐn)?shù))進(jìn)行雙固定，置于梯度乙醇中脫水，用Epon 812樹(shù)脂滲透包埋，切取厚60～80 nm的切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染，于透射電鏡(JEM-1200EX，JEOL，Japan)下觀察和拍照。

2 結(jié)果

2.1 顯微結(jié)構(gòu)

結(jié)果顯示：顏色正常的海帶配子體細(xì)胞呈褐色且分布均勻(見(jiàn)圖1a)；顏色變淺的配子體細(xì)胞內(nèi)容物向細(xì)胞中間聚集，細(xì)胞兩端顏色變淺，細(xì)胞色素分布不均勻(見(jiàn)圖1b、1c)；白色的配子體細(xì)胞出現(xiàn)空泡化(見(jiàn)圖1d)。另外，各種顏色的雌配子體細(xì)胞的外形保持完整。

2.2 超微結(jié)構(gòu)

顏色正常的配子體細(xì)胞內(nèi)外層之間有染色較深的顆粒帶，細(xì)胞色素體沿著細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)排列，每條色素體帶由3個(gè)清晰的類囊體組成，在色素體上類囊體之間散生或聚集有質(zhì)體小球，在細(xì)胞的中央有1個(gè)形狀不規(guī)則的細(xì)胞核(見(jiàn)圖2a)。顏色變淺的雌配子體細(xì)胞產(chǎn)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，色素體片層變得不明顯，并且產(chǎn)生空泡，細(xì)胞核分布的顆粒變得模糊，蛋白核形狀不規(guī)則(見(jiàn)圖2b)，細(xì)胞壁變厚，顆粒帶消失(見(jiàn)圖2c)。白色的雌配子體細(xì)胞中，有的內(nèi)部?jī)H剩下少量色素體(見(jiàn)圖2d)，其他細(xì)胞器消失；有的內(nèi)部完全空腔化，細(xì)胞壁邊緣變得粗糙(見(jiàn)圖2e)。

3 討論

3.1 種質(zhì)細(xì)胞死亡過(guò)程

正常海帶的雌配子體呈現(xiàn)均勻的褐色，細(xì)胞壁外層色淡，在內(nèi)外層之間常有染色較深的顆粒帶；色素體為長(zhǎng)橢圓形至長(zhǎng)帶形，沿著細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)分布，片層清晰；在色素體上類囊體之間散生或聚集有質(zhì)體小球，在細(xì)胞中央有1個(gè)不規(guī)則形的細(xì)胞核；線粒體多數(shù)分布于色素體的周邊，多為長(zhǎng)橢圓形；蛋白核一般呈梨形，窄端如柄，與色素體相連[5]。這與本研究的正常雌配子體細(xì)胞一致。但是本研究發(fā)現(xiàn)顏色變淺褐色的雌配子體細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)內(nèi)容物分布不均勻，質(zhì)壁分離，細(xì)胞器形狀發(fā)生變化的現(xiàn)象，而顏色變白的配子體細(xì)胞出現(xiàn)空腔化的現(xiàn)象，并且還發(fā)現(xiàn)這兩種海帶種質(zhì)細(xì)胞顯微和超微結(jié)構(gòu)最明顯的變化是細(xì)胞內(nèi)容物變得不均勻和色素體片層變得模糊。

在長(zhǎng)期保存的條件下，部分配子體細(xì)胞出現(xiàn)了變化，最直觀的表現(xiàn)就是顏色變化。對(duì)于變白色的較好判斷，說(shuō)明種質(zhì)細(xì)胞內(nèi)容物消失，種質(zhì)已經(jīng)死亡，但是，對(duì)于種質(zhì)還是褐色的則較難判斷其健康狀態(tài)。原因有兩個(gè)方面，一是根據(jù)作者長(zhǎng)期觀察，不同的海帶種類其種質(zhì)顏色有所區(qū)別；二是長(zhǎng)期保存的配子體細(xì)胞變化的過(guò)程是不明顯的，一旦出現(xiàn)肉眼能夠識(shí)別的顏色變化時(shí)種質(zhì)細(xì)胞基本處于不健康的狀態(tài)。因此，需要進(jìn)一步研究各類雌、雄配子體細(xì)胞的死亡過(guò)程，以確定低溫弱光保存的海帶種質(zhì)細(xì)胞死亡的特異性指標(biāo)，為海帶種質(zhì)長(zhǎng)期健康保存提供參考。

3.2 種質(zhì)細(xì)胞死亡原因

海帶細(xì)胞死亡的原因和過(guò)程多種多樣。如：在高濃度(0.67 mg/L)的丙溴磷[6]、褐藻酸降解菌[7]和紫外照射[8]作用下，海帶孢子體的色素體最敏感；UV-B對(duì)于發(fā)育期的配子體影響也較明顯，連續(xù)照射72 h的游孢子發(fā)育成的配子體，其細(xì)胞壁較厚，有破損，色素體的片層結(jié)構(gòu)不易區(qū)分[9]。本研究中的海帶雌配子體處于低溫弱光慢速的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，保存時(shí)間達(dá)十多年，部分雌配子體細(xì)胞發(fā)生顏色變淺現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較大空腔，其他細(xì)胞器消失時(shí)色素體仍然少量存在，且其細(xì)胞死亡不是受到強(qiáng)烈的理化或生物因素作用，而是在長(zhǎng)期保存過(guò)程中發(fā)生的，其死亡的類型[10]及其死亡機(jī)制，還需要有更多的不同保存時(shí)間的數(shù)據(jù)和分子結(jié)構(gòu)方面的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在低溫弱光條件下保存的海帶雌配子體細(xì)胞會(huì)部分出現(xiàn)顏色變淺或者變白。對(duì)顏色變淺的細(xì)胞在顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞內(nèi)容物出現(xiàn)分布不均勻，且向中央聚集的現(xiàn)象；超微結(jié)構(gòu)研究顯示其細(xì)胞器出現(xiàn)不規(guī)則或者降解的現(xiàn)象。白化細(xì)胞的內(nèi)容物中色素體僅殘存少量或已完全降解。

致謝：感謝中國(guó)海洋大學(xué)王高歌教授對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的專業(yè)指導(dǎo)。