田 淇，李 博

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及老齡化人口的增加，血栓性疾病的發(fā)病率和死亡率逐年上升，包括肺栓塞、腦卒中、心肌梗塞等常見(jiàn)病，已嚴(yán)重威脅中老年人的身體健康。心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)是血栓形成，而誘導(dǎo)血栓形成的關(guān)鍵因素是血小板的活化和聚集。因此，目前抗血小板治療已成為防治血栓類疾病的重要策略。然而，現(xiàn)有抗血小板藥物雖能有效緩解血栓的形成，但由于存在藥物抵抗或低應(yīng)答，并不適合所有患者，部分藥物還存在嚴(yán)重的并發(fā)癥(如腦出血、消化道大出血等)[1]。所以，尋求來(lái)源更廣泛更安全可靠的抗血小板活性物質(zhì)，對(duì)預(yù)防或延緩血栓性疾病具有重大意義。本文就近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的多種存在抗血小板激活、聚集等作用的生物活性肽及其作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 血小板激活機(jī)制

血小板是哺乳動(dòng)物血液中特有的成分之一，它是從骨髓中巨核細(xì)胞上脫落下的具有生物活性的胞質(zhì)成分[2]。正常狀態(tài)下，血小板均以無(wú)活性的形式存在，而在膠原、二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)、凝血酶、血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)等激動(dòng)劑誘導(dǎo)下，血小板膜表面相應(yīng)受體被激活，發(fā)生內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后血小板通過(guò)粘附、聚集、釋放等過(guò)程，參與機(jī)體內(nèi)的止血反應(yīng)，同時(shí)也在組織修復(fù)、炎癥反應(yīng)、器官移植排斥、血栓形成等病理過(guò)程中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用[3]。血小板活化信號(hào)通路呈網(wǎng)狀，多種激動(dòng)劑可通過(guò)不同通路激活血小板，且通路之間相互影響。其受體如圖1所示。

圖1 幾種主要的血小板受體及其信號(hào)通路[4]Fig.1 Several major platelet receptors and their signaling pathways

1.1 膠原

血小板膜上多種受體會(huì)通過(guò)血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)與膠原發(fā)生間接作用，包括整合素αⅡβ1、GPⅡb-Ⅲa、GPⅠb、GPⅥ等。血小板粘附到膠原后，GPⅥ會(huì)產(chǎn)生由內(nèi)到外的信號(hào)，從而刺激整合素的前激活，隨后釋放的第二波介質(zhì)如ADP和TXA2會(huì)加強(qiáng)前激活過(guò)程。GPⅥ在膠原誘導(dǎo)下的血小板活化、粘附、聚集、顆粒物釋放以及發(fā)揮促凝活性過(guò)程中起著核心作用。膠原與受體結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致多個(gè)激酶的級(jí)聯(lián)磷酸化并引起蛋白激活磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)的聚集，使磷脂酰肌醇二磷酸(Phosphatidylinositol diphosphate,PIP2)水解產(chǎn)生三磷酸肌醇(Inositol triphosphate,IP3)和二?；视?Diacylglycerol,DAG)。IP3可以促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+流出，DAG可以激活PLC進(jìn)而誘導(dǎo)致密顆粒的分泌和ADP的釋放。激活的蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高會(huì)刺激磷脂酶A2，釋放膜磷脂中的花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)[5]。AA在環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase,COX-1)作用下生成前列腺素，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為T(mén)XA2釋放到胞漿外[6]。

1.2 ADP

ADP是血小板活化的重要放大劑，正常狀態(tài)下，高濃度的ADP儲(chǔ)存于血小板的致密顆粒內(nèi)，當(dāng)血小板激活后，ADP被迅速釋放出來(lái)并激活其他血小板，進(jìn)一步放大血小板反應(yīng)。P2Y1和P2Y12是血小板表面的ADP受體。P2Y1受體激活后通過(guò)偶聯(lián)的Gq蛋白使血小板內(nèi)Ca2+水平升高。P2Y12受體激活后通過(guò)偶聯(lián)的Gi蛋白抑制腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase,AC)活性，同時(shí)激活磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)。AC活性下降可以降低環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平，并使得磷酸化的血管舒張劑刺激磷蛋白(Phosphoprotein,VASP)去磷酸化，而活化的PI3K又可使Akt(也稱為蛋白激酶B)發(fā)生磷酸化[7]，最終激活GPⅡb-Ⅲa。此外，活化的P2Y12受體可放大和維持TXA2和凝血酶引起的血小板反應(yīng)，并穩(wěn)定形成血栓。

1.3 TXA2

TXA2是在血小板活化后合成和分泌的一種重要介質(zhì)，多種激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板活化過(guò)程都伴隨著TXA2的合成和其介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大作用。血小板被激活后，膜上的AA會(huì)與COX-1作用產(chǎn)生前列腺類產(chǎn)物，之后進(jìn)一步生成TXA2，隨后TXA2擴(kuò)散到細(xì)胞外，激活其他血小板。TPα和TPβ是血小板表面的TXA2受體。當(dāng)TXA2與血小板表面的受體結(jié)合后，會(huì)通過(guò)血小板內(nèi)部偶聯(lián)的Gq、G12、G13蛋白激活PLC，活化的PLC進(jìn)而催化PIP2降解，釋放出第二信使IP3和DAG。IP3可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放，而DAG可激活血小板內(nèi)的PKC，引起蛋白磷酸化，并進(jìn)一步激活GPⅡb-Ⅲa[8]。

1.4 凝血酶

在血管損傷處，血液中的凝血酶原迅速產(chǎn)生凝血酶，凝血酶不但可以催化纖維蛋白原生產(chǎn)纖連蛋白，同時(shí)也是效應(yīng)最強(qiáng)的血小板激動(dòng)劑。凝血酶的激活作用主要是通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)的蛋白酶激活受體(protease activated receptors,PARs)介導(dǎo)的，PARs在凝血酶的作用下裂解掉氨基端外結(jié)構(gòu)域后被激活，并通過(guò)偶聯(lián)的G蛋白發(fā)揮作用[9]。人血小板膜上凝血酶的受體是PAR1和PAR4，其中PAR1與G12、G13、Gq、Gi蛋白偶聯(lián)，G12和G13可與Rho鳥(niǎo)苷酸交換因子結(jié)合，誘發(fā)Rho因子介導(dǎo)的細(xì)胞骨架反應(yīng)，導(dǎo)致血小板發(fā)生形狀改變[10]。Gq和Gi蛋白活化后同樣可引起上述改變。因此，凝血酶不僅可引起血小板的變形，還能促使血小板內(nèi)Ca2+水平升高和cAMP水平下降，從而激活GPⅡb-Ⅲa，使血小板活化。

各激動(dòng)劑激活血小板后，血小板變形、擴(kuò)散，并引起膜表面受體GPⅡb-Ⅲa構(gòu)象改變，變?yōu)楦哂H和力受體，進(jìn)而與二價(jià)纖維蛋白原等蛋白配體連接，介導(dǎo)血小板的粘附和聚集，最終導(dǎo)致血栓產(chǎn)生[11]。

1.5 常見(jiàn)的血小板藥物及其作用機(jī)制

目前臨床使用的抗血小板藥物主要分為:(1)阿司匹林(Aspirin)，通過(guò)不可逆地阻斷COX-1的合成，抑制TXA2的合成，從而抑制血小板的活化和聚集。(2)替格瑞洛(Ticagrelor)，通過(guò)可逆地與P2Y12受體相互作用，從而選擇性抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。(3)氯吡格雷(Clopidogrel)，通過(guò)不可逆地抑制ADP與受體P2Y12結(jié)合，從而選擇性抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。(4)Vorapaxar和Atopaxar是目前處于臨床試驗(yàn)階段的PAR1受體抑制劑[12]。(5)阿昔單抗(Abciximab)、依替巴肽(Integrilin)、替羅非班(Tirofiban)均屬于GPⅡb-Ⅲa受體拮抗劑，三者雖作用于同一受體，但結(jié)構(gòu)卻有所不同：阿昔單抗為抗β3單克隆抗體；而依替巴肽和替羅非班是模擬受體與纖維蛋白原結(jié)合的序列，其中，依替巴肽是7個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽[13]，而替羅非班為左旋酪氨酸非肽類結(jié)構(gòu)。

2 抗血小板肽

早在1984年就有研究證實(shí)RGDS序列是纖維蛋白原結(jié)合細(xì)胞的活性位點(diǎn)，能夠抑制血小板凝集和纖連蛋白結(jié)合到活化的血小板上，從而抑制血栓形成[14]。此后，從各種天然產(chǎn)物中[15]分離的抗血小板肽相繼出現(xiàn)。這些天然抗血小板肽的抗血小板聚集效果雖然沒(méi)有臨床藥物好，但其副作用小，因而備受關(guān)注。還有少數(shù)研究在天然抗血小板肽基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和人工合成，從而開(kāi)發(fā)抗血小板肽潛在的生物學(xué)價(jià)值和醫(yī)學(xué)價(jià)值。按來(lái)源可將抗血小板肽分為以下幾類：

2.1 動(dòng)物源抗血小板肽

乳與血液的凝固有許多的相似之處，除本身具有的抗凝因子外，經(jīng)酶解后的肽段也具有抗血小板活性。Qian等[16]從綿羊乳鐵蛋白的N端分離、提純出三條抗凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的肽段：TAQVTSTEV，QVTSTEV和KDQDK。實(shí)際上其N端序列殘基37-33 RKLGRPL與人乳鐵蛋白N端序列相同，具有相同抗血小板活性，其抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的IC50值為4 μM。酪蛋白作為乳的重要成分，不僅可以提供充足的氨基酸和氮源，還是生物活性肽的主要來(lái)源。Meddeb等[17]從牛乳κ-酪蛋白中提取出殘基106-116 AIPPKKNQDK以劑量依賴性方式抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集和纖維蛋白原結(jié)合。該十一肽比人纖維蛋白原β鏈的C端十二肽具有更強(qiáng)的抑制性。用胰蛋白酶酶解該十一肽得到兩條短肽：殘基106～112 MAIPPKK和殘基113-116 NQDK。這兩條短肽對(duì)血小板聚集的影響較小且不會(huì)抑制纖維蛋白原與血小板結(jié)合。Jolles等人[18]將從牛乳蛋白中分離出的四肽KRDS進(jìn)行構(gòu)象優(yōu)化得到KREE，其抗血小板活性高于早前發(fā)現(xiàn)的四肽KRDS和RGDS。四肽RGDS可以抑制ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，IC50值分別為32.3 μM和13.75 μM。

有部分研究關(guān)注了肉蛋白衍生肽的抗血小板活性，發(fā)現(xiàn)I型膠原含有氨基酸序列：DGEA[19]、FGN、GPR、RGD均具有抗血小板活性。Zied Khiari等[20]從鯖魚(yú)皮明膠的酶解物中提取出抗血小板三肽FGN。Maruyama等[21]從豬皮膠原的酶解物中提取出的三肽GPR抑制膠原和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，其IC50值為250 μM。某些膠原肽也具有抑制纖維蛋白原-凝血酶誘導(dǎo)血小板聚集的作用，但是不能抑制凝血酶的活性。Nonaka等[22]研究發(fā)現(xiàn)，膠原肽GPR及其衍生物能夠與纖維蛋白原結(jié)合并阻止纖連蛋白單體間發(fā)生聚合，從而選擇性抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，靜脈注射或口服三肽GPR以及豬皮膠原的酶解物可以抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的患有彌散性血管內(nèi)凝血大鼠體內(nèi)的血小板數(shù)量減少，也就是說(shuō)口服該三肽可以對(duì)血小板聚集起到抑制作用。

自然界中存在多種具有抗血小板活性的蛋白類物質(zhì)，到目前為止已從蚊蠅、水蛭、蜈蚣、蛇等生物體內(nèi)提取出具有良好活性的抗凝血和溶栓蛋白，通過(guò)酶解后分離純化得到活性更強(qiáng)的短肽。Kong等[23]從少棘蜈蚣(Scolopendramutilans)中分離出三肽SQL。在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，SQL以劑量依賴性方式抑制ADP誘導(dǎo)的人血小板聚集。同時(shí)，SQL可有效延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間(Activated partial thromboplastin time,APTT)，而凝血酶原時(shí)間(Prothrombin time,PT)不受影響，這可能是由于其對(duì)內(nèi)源性凝血途徑中的凝血因子發(fā)揮抑制作用，而不影響外源性凝血途徑。Hao等[19]從棕點(diǎn)湍蛙(Amolopsloloensis)皮膚分泌物中分離出多肽ZDPI(FRGCWLKNYSPRGCL-NH2)，能夠以劑量依賴性方式抑制ADP誘導(dǎo)的人血小板聚集，IC50值為12.27 μg/mL。Kato等[24]從白蛉沙蠅(Leishmaniaspp)的唾液中分離出的Ayadualin可通過(guò)影響纖維蛋白原與GPⅡb-Ⅲa的結(jié)合而顯著抑制凝血酶、ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集。Chen等[25]從蘄蛇毒水解物中分離出多肽ACH-11(LTFPRIVFVLG)。在0.1～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，ACH-11以劑量依賴性方式抑制ADP誘導(dǎo)的兔血小板聚集；同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)ACH-11可直接抑制FXa或FXa-底物復(fù)合物(Ki值為9.02 μM)，進(jìn)而發(fā)揮抗凝血作用；此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ACH-11可緩解ADP誘導(dǎo)的血栓形成，效果優(yōu)于阿司匹林，并且顯著延長(zhǎng)PT及APTT，但不影響出血時(shí)間(Bleeding time,BT)。

大量研究涉及蛇毒對(duì)血小板聚集的抑制作用，活性位點(diǎn)均為RGD序列。除ACH-11之外，研究人員從多種蛇毒中提純出了抗血小板肽，包括：Echistatin[26]，Trigramin，Rhodostomin，Arietin[27]，Halysin[28]，Gabonin[29]，NKV-66[30]，Triflavin[31]，Jerdonibitin[32]，Accutin[33]，pENW[34]，AAP[35]，LX0702[36]。

2.2 植物源抗血小板肽

植物源抗血小板作用主要來(lái)自于中草藥中的多酚類物質(zhì)，而抗血小板多肽的相關(guān)研究較少。目前，Hyun等[37]從藥用蘑菇(樺褐孔菌Inonotusobliquus)中提取、純化出三肽WGC，可以抑制膠原和ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，其抑制率高達(dá)91.6%，IC50值為0.16 mM。相對(duì)于其他血小板聚集抑制劑(如Bassiatin，IC50值為0.19 mM)，由于WGC具有較高的抑制血小板聚集活性且更安全，無(wú)副作用，因此被認(rèn)為是醫(yī)藥或功能性食品的更優(yōu)選擇。

近幾年科學(xué)家逐漸注意到種子貯藏蛋白的多肽鏈內(nèi)部可能普遍存在著功能區(qū)，選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆膺@些多肽，有可能將其釋放出來(lái)，從而制備生物活性肽。Lee和Kim[38,39]從大豆蛋白的水解產(chǎn)物中提純并鑒定了兩種活性最高的親水性抗血小板肽：SSGE和DEE。SSGE和DEE的IC50值分別為480、460 μM。均可以抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集。同時(shí)，大豆蛋白的水解物中多數(shù)組分具有抗血小板活性，表明水解物中的大多數(shù)肽具有抗血小板作用。于國(guó)泳等[40]從燕麥，青稞和蕎麥的酶解并模擬消化產(chǎn)物中提取出38條抗血小板肽，并從中篩選出了活性最高的9條肽：ALPIDVLANAYR，EFLLAGNNKR，GEEFGAFTPK，QLAQIPR，LQAFEPLR，ALPVDVLAN AYR，GEEFDAFTPK，QKEFLLAGNNK和TNPNSMVS HIAGK。這些肽通過(guò)以低結(jié)合能結(jié)合COX-1活性中心的方式抑制血小板聚集。所有水解產(chǎn)物均顯示出高抗血小板活性，并以劑量依賴性方式抑制血小板聚集，其中，燕麥球蛋白水解物的抗血小板活性最強(qiáng)，IC50值為0.282 mg/mL。通過(guò)蛋白酶水解這些種子貯藏蛋白所獲得的生物活性肽具有很多優(yōu)點(diǎn)：原料廉價(jià)、成本低、安全性好、不需要很嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件和很貴重的儀器設(shè)備、便于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 微生物源抗血小板肽

大多數(shù)重組的抗血小板肽選擇在酵母菌、枯草桿菌及大腸桿菌中表達(dá)，使工業(yè)化制備抗血小板肽成為可能，鮮有報(bào)道從微生物蛋白中分離抗血小板肽。Pytela等[41]從噬菌體文庫(kù)中分離出的環(huán)狀九肽ACRGDGWCG，通過(guò)抑制整合素αⅤβ1介導(dǎo)的受體與纖維蛋白原結(jié)合，從而抑制ADP和膠原誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集，IC50值為6 μM。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬，環(huán)肽ACRGDGWCG的類似物ACDCRGDCFCG同樣具有較高的抗血小板活性。

2.4 人工合成的抗血小板肽

近幾十年來(lái)，隨著基因工程和生物制藥技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家根據(jù)已知抗血小板肽序列和相關(guān)受體結(jié)構(gòu)優(yōu)化和開(kāi)發(fā)了多種新型高效抗血小板肽。Revacept(二聚體糖蛋白VI-Fc)通過(guò)清除激活血小板受體的關(guān)鍵配體，阻斷斑塊中的膠原與GPVI結(jié)合從而降低血小板粘附。Revacept能夠有效抑制膠原誘導(dǎo)的人血小板聚集，且呈劑量和時(shí)間依賴性，但不抑制ADP或凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集[42]。

N-{4-(4-Amidinophenoxy)butyryl}-a-L-aspartyl-L-valine(FK633)是一種人工合成的肽類似物，可以抑制凝血酶，ADP，膠原和血小板活化因子(Platelet-activating factor,PAF)誘導(dǎo)的人血小板聚集，IC50值分別為103、87、98、239 nM。FK633與四肽RGDS的抑制作用相似，但其效力比RGDS強(qiáng)約1 000倍。但與RGDS相比，F(xiàn)K633不會(huì)抑制濃度高達(dá)1.0 mM的整合素αⅤβ3和αⅤβ1介導(dǎo)的細(xì)胞粘附[43]。

SFLLRNPNDKYEPF是基于人凝血酶受體結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)合成的凝血酶受體拮抗劑?？梢酝ㄟ^(guò)抑制凝血酶引發(fā)的一些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，從而抑制血小板聚集?；趥}(cāng)鼠凝血酶受體(SFFLRNP-NH2)推導(dǎo)出的衍生七肽也同樣有效[44]。

(S,S)PSRCDCR-NH2衍生自整合素亞單位αⅡb。人血小板表面受體GPIIb-IIIa的亞單位αⅡb的313-332序列在與纖維蛋白原結(jié)合過(guò)程中起重要作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，(S,S)PSRCDCR-NH2能顯著抑制人血小板聚集。在電誘導(dǎo)兔動(dòng)脈血栓模型中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)股靜脈給予該肽后，與依替巴肽相比，能更顯著地延長(zhǎng)動(dòng)脈血流時(shí)間，減輕血栓質(zhì)量；且該肽還具有不影響凝血功能和BT的優(yōu)點(diǎn)[45]。

大量研究還發(fā)現(xiàn)其他具有抗血小板激活、聚集活性的肽段，除部分人工合成的肽類物質(zhì)會(huì)影響血小板功能外，多種食源性抗血小板肽也處于研發(fā)階段。下表為已報(bào)道的抗血小板肽序列信息。

表1 已報(bào)道的抗血小板肽序列

續(xù)表1(Continued Tab.1)

注：“-”表示未報(bào)道。

Note:“-” means not reported.

3 抗血小板肽的作用機(jī)理

3.1 纖維蛋白原受體拮抗劑

血小板膜上存在多種纖維蛋白原的受體，如整合素αⅡβ1、GPⅡb-Ⅲa和GPⅥ。整合素家族種類較多，與血小板相關(guān)受體主要有三種，纖連蛋白，玻連蛋白和纖維蛋白原的細(xì)胞表面受體，分別為：αⅤβ1整聯(lián)蛋白，αⅤβ3整聯(lián)蛋白，IIb-IIIa整聯(lián)蛋白。纖維蛋白原通過(guò)結(jié)合血小板表面上的特異性受體糖蛋白IIb-IIIa(GPIIb-IIIa)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致血小板的聚集。在纖維蛋白原序列上已確定了兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。首先，γ鏈的C端序列：HHLGGAKQAGV。第二，對(duì)應(yīng)于α鏈的殘基572-575或95-98的四肽序列：RGD(S或F)，這兩條肽都能抑制膠原與ADP誘導(dǎo)的血小板的聚集。

依替巴肽(Integrilin)[13]是美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)上市的第一種抗血小板多肽，是衍生自東南侏儒響尾蛇(Sistrurusmiliariusbarbouri)毒液中蛋白質(zhì)的環(huán)狀七肽Mpa-Har-GDWPC-NH2，屬GPIIb-IIIa受體拮抗劑。它活性基團(tuán)為Har-GD，該基團(tuán)通過(guò)模擬與纖維蛋白原結(jié)合的氨基酸序列，選擇性、競(jìng)爭(zhēng)性、可逆性抑制GPⅡb-Ⅲa與纖維蛋白原結(jié)合，進(jìn)而起到抗血小板聚集的作用。

RGD多肽及其衍生物和類似物：GPIIb-IIIa與配體的結(jié)合主要通過(guò)一個(gè)三肽序列，即RGD序列，RGD序列廣泛存在于纖維蛋白原中，是黏附蛋白與血小板表面受體相互作用的識(shí)別位點(diǎn)，含RGD序列肽段可競(jìng)爭(zhēng)性與GPIIb-IIIa識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，阻斷纖維蛋白原與血小板結(jié)合，進(jìn)而抑制血小板聚集[49]。其衍生物和類似物包括：人工合成的四肽RGDS[50]；人工合成的含2個(gè)RGD序列的小分子線性肽Z4A5[51]；從乳蛋白中分離出的KRDS[52]；對(duì)RGD周邊部分氨基酸進(jìn)行突變得到的三肽RWR[53]；以RGD為先導(dǎo)物而設(shè)計(jì)合成的AoGDW[54]；用液相法合成的新型多肽類似物RGD-苯乙胺衍生肽Ⅰ[55]；含RGD序列的線性模擬物Ac-RGD-pe[56]；含RGD序列的環(huán)狀模擬物cyclo-S-Ac-(AA1)-RGDC-OH[57]；在N端氨基處摻入水楊酸衍生的新型RGD類似物[58]；含有RGD序列的肽類似物W2002(Nα-acetyl-RGD-p-methoxyphenethylamine)[59]；從白蛉沙蠅的唾液中分離出的Ayadualin[24]；大部分蛇毒中的抗血小板多肽均含RGD結(jié)構(gòu)：Accutin[33]，Echistatin[26]，Trigramin，Rhodostomin，Arietin[27]，Halysin[28]，Gabonin[29]，NKV-66[30]，Triflavin[31]；從噬菌體文庫(kù)中分離出的環(huán)狀九肽ACRGDGWCG和增加二硫鍵合成的ACDCRGDCFCG；纖維蛋白原α鏈中的RGDF及其衍生肽GRGDSPK[41]、NIMEILRGDF，γ鏈中的LGGAKQAGDV[36]。

P1c是結(jié)締組織生長(zhǎng)因子中第4功能區(qū)的一個(gè)多肽序列，由17個(gè)氨基酸組成，能與人整合素αⅤβ3特異性結(jié)合，用其標(biāo)記的納米顆粒能與高度表達(dá)整合素αⅤβ3的肝癌細(xì)胞高度親和，該納米探針已成功用于腫瘤的體內(nèi)定位。P1c可以有效抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，同時(shí)抑制細(xì)胞內(nèi)ERK1-2信號(hào)通路的磷酸化，顯示P1c可能是通過(guò)抑制ERK1-2的磷酸化而實(shí)現(xiàn)對(duì)血小板聚集的抑制作用[55]。研究還證實(shí)，作為GPIIb-IIIa的配體，P1c可與該受體發(fā)生特異性結(jié)合而產(chǎn)生抗血小板作用。

3.2 凝血酶受體拮抗劑或凝血酶抑制劑

凝血酶的活性中心處于一個(gè)極性較強(qiáng)的縫隙中，因?yàn)榈孜锉仨毰c縫隙中的活性位點(diǎn)相結(jié)合從而使肽鍵斷裂，所以凝血酶具有較強(qiáng)的特異性。1990年，Rydel等[60]通過(guò)X射線晶體衍射闡明了水蛭素與凝血酶的結(jié)合方式，即水蛭素的N端在一定程度上阻塞了凝血酶的活性位點(diǎn)，而其較長(zhǎng)的C端則與凝血酶的帶正電荷的外結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。目前對(duì)水蛭素的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制研究比較深入，還有部分科學(xué)家對(duì)水蛭素結(jié)構(gòu)進(jìn)行重組和優(yōu)化。

天然水蛭素主要包括HV-l、HV-2和HV-3三種異構(gòu)體，均為由65～66個(gè)氨基酸組成的無(wú)糖基化單鏈多肽，相對(duì)分子量約為7 000 Da。水蛭素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的天然凝血酶特異性抑制劑。水蛭素能與凝血酶以摩爾比為1∶1的方式結(jié)合形成復(fù)合物，使凝血酶失活，阻止了凝血酶裂解纖維蛋白原，進(jìn)而抑制了纖連蛋白的形成。同時(shí)，水蛭素也能阻斷凝血酶誘導(dǎo)旳血小板反應(yīng)及凝血酶催化的止血反應(yīng)[61]。

比伐盧定(Bivalirudin)于2 000年被批準(zhǔn)在美國(guó)上市，是一種近年來(lái)用于臨床的直接凝血酶抑制劑，其主要成分是水蛭素的二十肽類似物。通過(guò)可逆地與凝血酶催化位點(diǎn)特異性結(jié)合，直接抑制凝血酶的活性，從而抑制凝血酶所誘導(dǎo)和催化的反應(yīng)[62]。

WP-30(VISRTQSNVQAAWGQVGGHAADYSAVAIER)是從干燥水蛭中分離純化出一種多肽，屬凝血酶受體拮抗劑。研究發(fā)現(xiàn)，WP-30可能通過(guò)干擾凝血酶與受體結(jié)合，從而以劑量依賴性方式抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，IC50值為445.1 μM。但對(duì)U46619及膠原誘導(dǎo)的血小板聚集抑制作用較弱。同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WP-30能緩解小鼠體內(nèi)血栓的形成，且呈劑量依賴性[63]。

3.3 粘附受體GPIb拮抗劑

GPIb是血小板膜上的主要粘附受體，參與血小板相關(guān)疾病。然而，使用生理配體在體內(nèi)研究GPIb特異性識(shí)別是十分困難的。GPIb結(jié)合蛇毒C型凝集素(Snaclecs)是體外探索GPIb的常用方法。蛇毒含有許多生物成分，其通過(guò)破壞內(nèi)皮或影響凝血因子并最終影響血小板功能而發(fā)揮作用。具體來(lái)說(shuō)，由α、β異二聚體組成的蛇毒C型凝集素低聚化后形成大分子與特異性血小板受體如GPⅠb、αⅡβ1或GPⅥ受體相互作用，從而抑制血小板功能。

Chen等[32]從竹葉青蛇(Trimeresurusjerdonii)蛇毒中提取出一種名為Jerdonibitin的新型蛇毒C型凝集素能夠與GPIb特異性結(jié)合。氨基酸序列顯示Jerdonibitin不僅是一種蛇毒C型凝集素，而且與一種GPIb受體抑制性蛇毒C型凝集素TSV-GPIb-BP具有序列相似性。Jerdonibitin劑量依賴性地抑制低劑量凝血酶或瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集，但不抑制高劑量凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集。許多研究表明GPIb是凝血酶受體，特別是在凝血酶劑量低時(shí)。在體內(nèi)，Jerdonibitin也劑量依賴性地使小鼠的血小板數(shù)量降低，并且在靜脈注射18小時(shí)后血小板計(jì)數(shù)仍保持在非常低的水平。

3.4 TXA2合成酶抑制肽

AA代謝在血小板聚集過(guò)程中起到了重要作用，COX-l是AA代謝產(chǎn)生TXA2過(guò)程中關(guān)鍵限速酶。于國(guó)泳[40]研究發(fā)現(xiàn)，燕麥抗血小板聚集肽能顯著抑制AA代謝過(guò)程中COX-l的活性從而抑制TXA2的生成。計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果表明，燕麥球蛋白族蛋白酶水解物可通過(guò)進(jìn)入COX-1活性中心，與其中的氨基酸通過(guò)氫鍵、共價(jià)鍵和范德華力結(jié)合，產(chǎn)生空間位阻，引起COX-1活性中心構(gòu)象改變，從而競(jìng)爭(zhēng)性地抑制COX-1活性，從而介導(dǎo)AA代謝途徑減少TXA2的生成，進(jìn)而抑制血小板聚集。

3.5 其他

myr-RKEFAK是模擬GPⅡb-Ⅲa的β3亞單位C端α螺旋上6個(gè)氨基酸序列(RKEFAK)肽段，并通過(guò)十四烷酰化修飾而形成的肽模擬物。研究發(fā)現(xiàn)myr-RKEFAK的抗血小板作用可能與選擇性調(diào)控血小板信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。myr-RKEFAK可以濃度依賴性地抑制血小板固相化纖維蛋白原上穩(wěn)定黏附和伸展、二相聚集以及纖維蛋白塊回縮等外向內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，但不影響游離纖維蛋白原結(jié)合和一相聚集等內(nèi)向外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[64]。

CGHC是一種基于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerase,PDI)氧化還原序列設(shè)計(jì)合成的四肽。PDI在血小板聚集中起主要作用，其抑制劑已成為新型抗血栓藥物。CGHC抑制PDI還原酶活性和由嗜中性粒細(xì)胞NOX-2產(chǎn)生的PDI調(diào)節(jié)的超氧化物。研究發(fā)現(xiàn)，CGHC的中間兩個(gè)氨基酸并不影響該肽的抗血小板活性，在凝血酶活化的血小板中，CxxC以劑量依賴性方式抑制血小板聚集，在較低的激動(dòng)劑濃度下更有效。CxxC肽通過(guò)與PDI中的Cys400結(jié)合(一種PDI促血栓形成活性的重要位點(diǎn))顯著抑制血小板聚集和活化，而不干擾顆粒分泌。揭示了其抗血小板活性的潛在機(jī)制，PDI的C端CGHC序列的反應(yīng)性半胱氨酸對(duì)血栓形成具有重要意義[65]。

4 結(jié)語(yǔ)

抗血小板治療在血栓性疾病的防治中具有關(guān)鍵作用。盡管目前臨床上使用的抗血小板藥物種類良多，但仍存在一定的局限性：出血風(fēng)險(xiǎn)高、副作用大、個(gè)體差異性大(如某些藥物需肝細(xì)胞色素P450 酶代謝形成活性代謝物)，半衰期短等。

自然界中存在大量具有抗血小板活性的蛋白類物質(zhì)，到目前為止已經(jīng)從沙蠅、水蛭、蛇、蛙等生物體內(nèi)提取出具有良好活性的抗凝血和溶栓蛋白。但這些物質(zhì)大都從吸血類動(dòng)物的毒液中提取，安全性差且副作用沒(méi)有得到改善。而從食源性蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的具有抗血小板活性的小分子肽類化合物具有安全、可食用、營(yíng)養(yǎng)、來(lái)源廣泛等特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)利用前景廣泛。雖然大部分抗血小板肽的活性低于抗血小板藥物，但通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化和設(shè)計(jì)合成將會(huì)開(kāi)發(fā)出多種新型高效的抗血小板肽類似物，具有一定的臨床應(yīng)用潛力。另一方面越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)抗血小板藥物的聯(lián)合治療獲得的收益更大，而食源性蛋白水解物可抑制多種途徑誘導(dǎo)的血小板激活和聚集，故抗血小板肽適合開(kāi)發(fā)成具有預(yù)防或緩解血栓形成功能的多靶向的精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品。因此，深入研究食源性抗血小板肽及其作用機(jī)理，將為今后抗血小板肽作為膳食補(bǔ)充劑用于功能食品，或用于血栓類疾病的防治提供新的策略和依據(jù)。