陶曉玲 熊俊 陽艷 方敏 李蕓蕓

[摘要] 目的 探討外周血中高遷移率族蛋白B1（HMGB1）水平與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者輔助性T細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞平衡的關(guān)系。 方法 選擇2016年1月～2018年1月在湖北省婦幼保健院（以下簡稱“我院”）進(jìn)行治療的不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者83例為觀察組，選擇同期在我院進(jìn)行產(chǎn)前檢查的健康孕婦80名為對(duì)照組。入院后采集兩組受試者的空腹靜脈血，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其Th17、Treg細(xì)胞水平，并進(jìn)行組間比較。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)兩組受試者的HMGB1、晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-10、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）水平。并探討HMGB1與各細(xì)胞及細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果 觀察組HMGB1、RAGE、Th17、Th17/Treg水平高于對(duì)照組，其Treg水平低于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。觀察組IL-6、IL-17水平高于對(duì)照組，IL-10、TGF-β水平低于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。Pearson相關(guān)性分析顯示，HMGB1與Th17、Th17/Treg、RAGE、IL-6、IL-17水平呈正相關(guān)（r = 0.456、0.489、0.528、0.397、0.438，均P < 0.05），與Treg、IL-10、TGF-β水平呈負(fù)相關(guān)（r = -0.552、-0.523、-0.439，均P < 0.05）。 結(jié)論 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的外周血中HMGB1水平與Th17/Treg平衡間有一定的相關(guān)性，HMGB1、Th17、Treg的異常表達(dá)及Th17/Treg失衡可能參與了不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞] 高遷移率族蛋白B1;復(fù)發(fā)性流產(chǎn);Th17/Treg細(xì)胞;相關(guān)性

[中圖分類號(hào)] R714.21? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）02（c）-0094-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the high mobility group box protein B1 （HMGB1） level in peripheral blood and the helper T cell 17 （Th17）/regulatory T （Treg） cell balance in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion. Methods From January 2016 to January 2018， 83 patients with unexplained recurrent abortion who were treated in Hubei Maternal and Child Health Hospital （"our hospital" for short） were selected as the observation group， and 80 healthy pregnant women who underwent prenatal examination in our hospital during the same period were selected as the control group. Fasting venous blood was collected after admission. Th17 and Treg cell levels were measured by flow cytometry and compared between the two groups. The levels of Th17 and Treg cells were detected by flow cytometry and compared between groups. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the levels of HMGB1， advanced glycation end product receptor （RAGE）， interleukin-6 （IL-6）， IL-10， IL-17， and transforming growth factor-β （TGF-β）. The relationship between HMGB1 and the expression of various cells and cytokines was also investigated. Results The levels of HMGB1， RAGE， Th17 and Th17/Treg in the observation group were higher than those in the control group， and the Treg was lower than that in the control group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The levels of IL-6 and IL-17 in the observation group were higher than those in the control group， and the levels of IL-10 and TGF-β were lower than those in the control group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Pearson correlation analysis showed that HMGB1 was positively correlated with Th17， Th17/Treg， RAGE， IL-6， IL-17 levels （r = 0.456， 0.489， 0.528， 0.397， 0.438， P < 0.05）. There was a negative correlation between the levels of HMGB1 and Treg， IL-10 and TGF-β （r = -0.552， -0.523， -0.439， P < 0.05）. Conclusion There is a certain correlation between HMGB1 level and Th17/Treg balance in peripheral blood of patients with unexplained recurrent abortion. The abnormal expression of HMGB1， Th17 and Treg and the imbalance of Th17/Treg may be involved in the occurrence of unexplained recurrent abortion.

[Key words] High mobility group chromosal protein B1; Recurrent spontaneous abortion; Th17/Treg cell; Correlation

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指孕婦在妊娠過程中出現(xiàn)連續(xù)3次及3次以上次數(shù)的自然流產(chǎn)，其發(fā)生的原因多數(shù)與患者自身的內(nèi)分泌紊亂、感染因素、遺傳因素、生殖器官的解剖學(xué)形態(tài)異常等有關(guān)。而在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中約有30%～50%患者的發(fā)病原因仍不明確，臨床上將此類流產(chǎn)稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[1]。隨著研究的不斷深入，此類不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生機(jī)制的研究取得了一定的進(jìn)展，主要認(rèn)為是孕婦在妊娠早期時(shí)母體對(duì)胎兒產(chǎn)生的免疫反應(yīng)導(dǎo)致，其中表現(xiàn)最為顯著為輔助性T細(xì)胞17（Th17）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在母體對(duì)胎兒間的相互作用導(dǎo)致免疫耐受、免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，Th17、Treg細(xì)胞的水平異常及比例的失衡是主要的病理機(jī)制[2-3]。外周血高遷移率族蛋白B1（high mobility group chromosal protein B1，HMGB1）、晚期糖基化終產(chǎn)物受體（advanced glycation end product receptor，RAGE）是一種作用較強(qiáng)的免疫炎性反應(yīng)因子，可參與機(jī)體內(nèi)一系列炎性反應(yīng)的發(fā)生和進(jìn)展，并加重機(jī)體的炎性反應(yīng)[4-5]。既往的報(bào)道顯示[6-7]，HMGB1、RAGE水平在病理性妊娠患者中有顯著的變化，提示HMGB1、RAGE可能參與了患者的異常妊娠過程。因此，本研究中通過對(duì)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女的HMGB1、RAGE、Th17、Treg及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)分析，探討HMGB1與Th17/Treg平衡間的關(guān)系，以期為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的機(jī)制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月～2018年1月在湖北省婦幼保健院（以下簡稱“我院”）進(jìn)行治療的不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者83例作為觀察組，年齡21～35歲，平均（27.72±5.42）歲，孕齡6～20周，平均（14.33±3.86）周。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)診斷確診為不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，有3次及以上次數(shù)的自然流產(chǎn)史;②未發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)的相關(guān)病因;③精神狀態(tài)正常，能夠配合研究過程的進(jìn)行。排除標(biāo)準(zhǔn)：①自然流產(chǎn)有明確的病因;②并發(fā)全身惡性腫瘤疾病、自身免疫性疾病等影響本研究各項(xiàng)指標(biāo)水平的判斷。選擇同期在我院進(jìn)行產(chǎn)前檢查的健康孕婦80名作為對(duì)照組，年齡20～38歲，平均（29.08±5.79）歲，孕齡7～19周，平均（13.76±3.37）周。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)及檢查方法

統(tǒng)計(jì)兩組的HMGB1、RAGE、Th17、Treg、Th17/Treg等指標(biāo)，并比較兩組受試者的Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-17和Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β水平。

入院后，采集兩組受試者空腹靜脈血約5 mL，加入到抗凝管中，經(jīng)Ficoll密度梯度離心機(jī)（德國Sigma）離心，分離得到外周血的單細(xì)胞，并制備成細(xì)胞混懸液，采用Attune NxT流式細(xì)胞儀（美國賽默飛世爾科技公司）檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞，并計(jì)算Th17/Treg比例。血液樣本經(jīng)TGL-16K高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）離心分離，得到血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)HMGB1、RAGE、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-10、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），相關(guān)檢測(cè)試劑盒均購自美國R&D公司，操作步驟嚴(yán)格按說明書要求進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者HMGB1、RAGE、Th17、Treg、Th17/Treg水平比較

觀察組HMGB1、RAGE、Th17、Th17/Treg水平高于對(duì)照組，Treg水平低于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 兩組患者IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β水平比較

觀察組患者的IL-6、IL-17水平高于對(duì)照組，IL-10、TGF-β水平低于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 HMGB1與各指標(biāo)相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，HMGB1與Th17、Th17/Treg、RAGE、IL-6、IL-17水平呈正相關(guān)（r = 0.456、0.489、0.528、0.397、0.438，均P < 0.05），與Treg、IL-10、TGF-β水平呈負(fù)相關(guān)（r = -0.552、-0.523、-0.439，均P < 0.05）。

3 討論

近年來，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者呈逐漸增多的趨勢(shì)，其中有較高比例的患者均為不明原因的自發(fā)性流產(chǎn)，嚴(yán)重威脅廣大的妊娠期孕婦的生命健康和生活質(zhì)量，不利于患者正常的妊娠分娩過程的完成。隨著發(fā)病率的增加，臨床對(duì)其關(guān)注度不斷提高，并不斷深入探討其自發(fā)流產(chǎn)病因，其中患者自身的免疫學(xué)因素與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病理機(jī)制間的關(guān)系頗受臨床研究者的關(guān)注[8-9]。母體與胚胎直接接觸的組織部位在臨床上被稱為母胎界面，正常妊娠的孕婦的母胎界面存在著一定數(shù)量的免疫細(xì)胞，通常情況下，這些免疫細(xì)胞的存在及適宜比例的分布可形成特有的免疫耐受狀態(tài)，有利于妊娠并保護(hù)胎兒正常分娩過程的進(jìn)行[10]。但是在某些病理因素的影響下，母胎界面的免疫細(xì)胞數(shù)量和功能發(fā)生改變，如各種炎性細(xì)胞因子水平的增加，調(diào)節(jié)并作用于患者自身的固有免疫反應(yīng)，增加了妊娠期孕婦感染、自身免疫性疾病、排斥反應(yīng)的發(fā)生概率，不利于孕婦妊娠過程中子宮胚胎的發(fā)育及營養(yǎng)的供給，增加了孕婦母體對(duì)胚胎的免疫排斥反應(yīng)，從而導(dǎo)致妊娠的失敗，出現(xiàn)復(fù)發(fā)性的流產(chǎn)[11-12]。HMGB1是一種能夠參與機(jī)體組織細(xì)胞的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及修復(fù)過程的DNA伴侶性蛋白。多項(xiàng)研究[13-14]報(bào)道證實(shí)，HMGB1參與了患者的免疫炎性反應(yīng)，并且在病理性妊娠患者中檢測(cè)到HMGB1、RAGE水平的異常表達(dá)。在炎性反應(yīng)的刺激下，HMGB1、RAGE等水平的異常增高表達(dá)，使得高濃度的HMGB1、RAGE暴露在母胎界面，從而引起免疫功能的失調(diào)，繼而導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生[15]。因此，探討HMGB1與Th17/Treg平衡間的相關(guān)性，可為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療提供幫助。

本研究通過比較復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者和正常妊娠孕婦的各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)觀察組患者的HMGB1、RAGE、Th17、Th17/Treg水平高于對(duì)照組，Treg水平低于對(duì)照組。在相關(guān)細(xì)胞因子水平的比較中，觀察組患者的IL-6、IL-17水平高于對(duì)照組，IL-10、TGF-β水平低于對(duì)照組，提示在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中的HMGB1、RAGE、Th17、Treg、Th17/Treg及相關(guān)細(xì)胞因子水平IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β與正常孕婦相比發(fā)生了顯著的變化。另外，患者體內(nèi)的Th17過度表達(dá)，會(huì)抑制Treg細(xì)胞表達(dá)，從而使復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦體內(nèi)出現(xiàn)過度免疫耐受，從而證實(shí)了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的出現(xiàn)與Th17與Treg細(xì)胞表達(dá)異常及比例的失衡有關(guān)[16-17]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的HMGB1、RAGE水平明顯升高，表明此類患者體內(nèi)出現(xiàn)了炎性反應(yīng)，導(dǎo)致患者母胎界面的免疫功能的失調(diào)。本研究中HMGB1與Th17、Th17/Treg、RAGE、IL-6、IL-17水平呈正相關(guān)，與Treg、IL-10、TGF-β水平呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證明了HMGB1參與了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的Th17/Treg平衡的調(diào)節(jié)[18-19]。分析其原因，HMGB1通過作用于Th17細(xì)胞促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放，從而使得Th17細(xì)胞及相關(guān)炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-17水平隨著HMGB1的增加而增加，且呈正相關(guān)。HMGB1通過作用于Treg細(xì)胞而參與免疫抑制因子的調(diào)控，使得Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β水平隨著HMGB1的增加而減少，且呈負(fù)相關(guān)性。HMGB1通過對(duì)患者Th17和Treg兩個(gè)方面的調(diào)節(jié)，使患者的Th17/Treg比例平衡被打破[20-21]。HMGB1與RAGE呈正相關(guān)，這是因?yàn)镠MGB1的高表達(dá)可誘導(dǎo)RAGE水平的增加，HMGB1可與患者的RAGE受體結(jié)合，直接參與機(jī)體的免疫炎性反應(yīng)。

綜上所述，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的外周血HMGB1、RAGE水平會(huì)顯著升高，Th17細(xì)胞、Th17/Treg及相關(guān)細(xì)胞因子水平IL-6、IL-17水平顯著增加，而Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β水平則顯著降低。提示HMGB1、Th17、Treg的異常表達(dá)及Th17/Treg失衡可能參與了不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生。

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（收稿日期：2018-08-07? 本文編輯：王? ?蕾）