于凌嬌，張履冰，王闊鵬，劉倩宏

布魯氏菌病的診斷方法主要包括流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷、病理變化、細菌學(xué)和血清學(xué)診斷[1]。血清學(xué)方法有快速準確等諸多優(yōu)越性，是國際上最常用的診斷方法。但其不能用于區(qū)分動物的天然感染和后天免疫。且一些其它革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 、沙門氏菌等亦有類似的脂多糖 O-鏈結(jié)構(gòu)，與布魯氏菌存在嚴重的血清學(xué)交叉反應(yīng)，易產(chǎn)生假陽性。因此，新型診斷抗原的篩選成為關(guān)鍵[2]。

實驗室前期建立噬菌體展示布魯氏菌16M株基因組文庫，擬從該文庫中篩選具有良好抗原性的診斷制劑，為新型診斷方法建立奠定基礎(chǔ)。本研究利用Touch-down PCR技術(shù)對建立的文庫進行評價，檢測文庫插入片段的隨機性及多樣性，為后續(xù)試驗奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料與主要儀器

噬菌體展示馬耳他布魯氏菌16M株基因組文庫(本實驗室前期構(gòu)建)；無菌水；Taq MasterMix(購自康為世紀生物有限公司)；標準DNA marker；質(zhì)粒pYW01。pYWF、pYWR(長春庫美生物公司合成)。

LB液體培養(yǎng)基(含20 μg/mL氯霉素)：稱取胰蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.5 g，NaCL 0.25 g，用去離子水定容補足體積至50 mL。加熱融化，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至偏堿性。待蒸汽滅菌后，將培養(yǎng)基放置水浴鍋中，待溫度降至40 ℃左右添加氯霉素以20 μg/mL的終濃度添加于培養(yǎng)基中。

LB固體培養(yǎng)基(含20 μg/mL氯霉素)：稱取胰蛋白胨2 g，酵母提取物2 g，NaCL 1 g，瓊脂糖4 g，用去離子水定容補足體積至500 mL。待蒸汽滅菌后，將培養(yǎng)基放置水浴鍋中，待溫度降至40 ℃左右添加氯霉素以20 μg/mL的終濃度添加于培養(yǎng)基中。冷卻之前倒板保存。

1%瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液：取EDTA 4.4 g，溴酚藍250 mg，二甲苯腈藍FF250 mg，溶于200 mL蒸餾水加熱攪拌溶解。加入180 mL甘油后，用NaOH調(diào)PH至7.0。蒸餾水定容至500 mL，分裝保存。

1%瓊脂糖凝膠：稱取0.3 g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入30 mL 1×TAE緩沖液，瓶口倒扣小燒杯，微波爐加熱煮沸至瓊脂糖全部融化溶液澄清透明為止，大約需2 min，取出搖勻，冷卻至60 ℃以下，加入2 μL EB，搖勻。(注意：一定要等冷卻至60 ℃以下再加入EB，EB高溫揮發(fā)致癌性較強，全程要戴手套操作。)

PCR擴增儀(BIO-RAD 621BR28014 Made in Singapore );超凈臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司BSC-1100ⅡA2)；穩(wěn)壓電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司JY3OOE)；搖床(上海領(lǐng)成生物科技有限公司TC-200B)；凝膠成像儀(Prism LPMPL230-12070010)；無菌恒溫培養(yǎng)箱(Thermol)。

1.2 試驗方法

1.2.1 復(fù)蘇噬菌體展示布魯菌基因組文庫 取出-80 ℃保存的基因文庫，用接菌環(huán)蘸取適量菌液，涂布于LB固體平板(含 20 μg/mL 的氯霉素)；靜置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，次日觀察菌落形態(tài)；并挑取單菌落導(dǎo)入到5 ML新鮮LB液體培養(yǎng)基中(含 20 μg/mL 的氯霉素)，37 ℃180 rmp 條件下?lián)u動培養(yǎng)12-16 h，此即為復(fù)蘇布魯氏菌基因組文庫。

1.2.2 檢測布魯菌基因組文庫容量 將新鮮的布魯氏菌基因組文庫菌液10倍比稀釋，并將不同稀釋倍數(shù)菌液分別涂布于LB固體培養(yǎng)基中(含 20 μg/mL 的氯霉素)。37 ℃靜置培養(yǎng)過夜。次日觀察單菌落個數(shù)，按照以下公式計算基因文庫容量。菌落數(shù)(cfu/ mL)=單菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×100。

1.2.3 引物設(shè)計及合成 根據(jù)pYW01質(zhì)粒序列，利用primer 5.0設(shè)計引物，引物序列如下：

上游引物(F)5′AACATATGAAATACCTGCTGCCGAC 3′；下游引物(R)5′TCTTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCT 3′。(引物由長春庫美生物公司合成)。

將合成好的引物放入離心機瞬離然后放入超凈臺內(nèi)，關(guān)閉風(fēng)機，輕輕打開裝有引物的離心管，取37 μL 蒸餾水輕緩稀釋。(注意：打開離心管要輕，防止引物跑出去)。

1.2.4 PCR體系及運行條件建立 由于插入質(zhì)粒pYW01中的外源片段大小在0.3-2.0 kb之間，因此建立的文庫為隨機文庫。因此，我們利用Touch-down PCR方法對不同大小質(zhì)粒進行擴增。

Touch-down PCR反應(yīng)體系如下：

圖1 PCR檢測結(jié)果1泳道為10000marker，條帶大小如圖所示; 2-17泳道為 PCR 鑒定結(jié)果。

Touch-down PCR運行條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30sec，65 ℃30sec，72 ℃ 1 min，其中退火溫度從65 ℃依次降落到50 ℃，溫度每降一度運行兩個循環(huán)，最后50 ℃運行10個循環(huán)，共計40個循環(huán)。

1.2.5 布魯氏菌基因組文庫插入效率及隨機性檢測 以pYWF、pYWR為上下游引物，利用Touch-down PCR對基因文庫進行擴增，檢測其插入效率及隨機性。

以1%瓊脂糖凝集電泳檢測結(jié)果。將制膠板洗凈晾干，置于水平位置，并放好樣品梳子。將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液緩緩倒入制膠槽內(nèi)。待膠凝固后，取出梳子，將膠槽放在已倒好電泳緩沖液的電泳槽中進行點樣。

取5 μL樣品溶液和2 μL上樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔中。加5 μL marker于另一孔。上樣完畢后，調(diào)電泳儀各參數(shù)(U：80 V；A；200 A；T：40 min)進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 試驗結(jié)果

2.1 基因組文庫容量檢測

觀察培養(yǎng)布魯氏菌基因組文庫菌液平板上， 共生長了約26個單菌落， 則庫容量檢測結(jié)果為：26×100

×100=2.6×105pfu/mL。達到建庫要求，進行文庫插入效率及隨機性檢測。

2.2 布魯氏菌基因組文庫插入效率及隨機性檢測

以布魯氏菌16M基因組文庫為模板進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果，如圖1所示。

由圖1可見，第2、4、5、7、8、9、11、13、14、15、16、17泳道為陽性，且陽性條帶位置大小不一，插入效率達到75%以上。結(jié)果表明片段成功高效插入噬菌體載體pYW01中，且插入的片段大小不一，具有較好的隨機性。結(jié)果表明，實驗室前期構(gòu)建的噬菌體展示布魯氏菌16M株基因組文庫具有良好的插入效率及隨機性，滿足建庫要求，符合后續(xù)篩選需要。

3 討 論

為了篩選出布魯氏菌新型診斷抗原，為該病診斷方法的完善奠定基礎(chǔ)。實驗室前期利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了布魯氏菌16M株基因組文庫，以滿足實驗大范圍的篩選需要。為檢測實驗前期構(gòu)建文庫的隨機性及多樣性，本研究利用Touch-down PCR對構(gòu)建的噬菌體展示布魯氏菌基因組文庫進行評價[3]。

傳統(tǒng)PCR方法退火溫度越低，引物和底物越容易結(jié)合，錯配情況增多，造成PCR特異性降低，產(chǎn)物混入預(yù)期外片段[4]。退火溫度高則會引起擴增效率下降,甚至無擴增產(chǎn)物出現(xiàn)。Touch-down PCR也稱降落PCR。其原理是，選定一個退火溫度范圍，隨著退火溫度的降低，特異性逐漸降低，但在較高溫度下特異帶已被放大，其濃度遠高于非特異性帶，并且隨著退火溫度的降低，特異帶優(yōu)先擴增[5]。 Touch-down PCR程序與傳統(tǒng)PCR程序相比能夠很好的避免使用復(fù)雜基因組模板時非特異性PCR產(chǎn)物的出現(xiàn)，不僅提高了目的基因組模板的相對特異性，還具有分辨率高、重復(fù)性好等優(yōu)點，可以敏感、準確、快速地鑒定基因組文庫插入效率，滿足本試驗臨床大規(guī)模篩選和檢測的需要[6]。

因引物大小為100bp，且由于插入質(zhì)粒pYW01中的外源片段為隨機大小，因此建立的文庫為隨機文庫，且插入序列大小在0.3-2.0kb之間。以布魯氏菌16M基因組文庫為模板進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果所示第3、6、10、12泳道條帶為陰性，第2、4、5、7、8、9、11、13、14、15、16、17泳道為陽性，且陽性條帶位置大小不一，插入效率達到75%以上。(注：第2、3、4、5、7泳道上為引物二聚體，第7、8、15泳道上出現(xiàn)兩條條帶，是引物特異性的問題，不影響結(jié)果的分析)，結(jié)果表明，實驗室前期構(gòu)建的布魯氏菌16M株基因組文庫具有良好的多樣性及隨機性，滿足建庫要求，符合后續(xù)篩選需要[7-8]。

4 結(jié) 論

研究通過PCR技術(shù)對實驗室前期構(gòu)建的布魯氏菌基因組文庫進行評價，根據(jù)電泳圖譜表明；插入片段大小數(shù)量不一。結(jié)果表明；插入片段具有良好的隨機性及多樣性。