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(1.揚州市職業(yè)大學(xué),江蘇揚州 225009; 2.揚州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,江蘇揚州 225002)

微乳液是由油、水、表面活性劑和助表面活性劑按照適當(dāng)比例混合后自發(fā)形成的各向同性、透明、熱力學(xué)穩(wěn)定的分散體系[1-2]。微乳液具有超低的界面張力、納米級的分散相尺寸(10～200 nm)以及較高的增溶能力[3-5],在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域被廣泛用作藥物、生物活性物等的優(yōu)良載體[6-8]。相比于其他行業(yè),食品微乳化技術(shù)要求較高,安全性、生物相容性等問題使得表面活性劑、油相等原料在食品級微乳液的制備中受到限制。

橄欖油富含不飽和脂肪酸、抗氧化物等營養(yǎng)成分和活性成分,具有降血脂、降血壓、抗癌等保健功效[9-10],是醫(yī)學(xué)界公認的、最有益于人體健康的食用油之一。然而,橄欖油中不飽和脂肪酸大多水溶性差,對氧氣、光、熱敏感,極易氧化而變質(zhì),大大影響了其功效,也因此限制了橄欖油的應(yīng)用范圍。龔麗等[11]利用乳化均質(zhì)技術(shù)及添加復(fù)合穩(wěn)定劑,制備了具有一定穩(wěn)定性的橄欖油乳狀液。Papadimitriou等[12]以大豆卵磷脂為表面活性劑、正丙醇為助表面活性劑對不同等級橄欖油進行微乳化,并比較了不同橄欖油微乳體系對酶催化活性的影響。Amiri-Rigi等[13]則采用大豆卵磷脂/正丙醇/橄欖油/水微乳體系從番茄渣中提取了番茄紅素。

為進一步提高橄欖油微乳配方的安全性、擴大體系的微乳區(qū)間,選取天然表面活性劑大豆卵磷脂與非離子表面活性劑司盤80復(fù)配作為混合表面活性劑,乙醇為助表面活性劑,對橄欖油進行微乳化。通過擬三元相圖法考察不同親水親油平衡值(HLB值)、表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比(Km值)及水相中NaCl、甘油含量對微乳體系相行為的影響,探討橄欖油微乳液的形成規(guī)律。并在此基礎(chǔ)上,通過電導(dǎo)率、負染-透射電鏡等方法,分析橄欖油微乳體系的結(jié)構(gòu),為后續(xù)研究橄欖油微乳液對物質(zhì)的增溶及釋放、擴大微乳液在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆卵磷脂(Lecithin,純度大于70%,如圖1a) 阿拉丁試劑公司;司盤80(Span80,如圖1b)、橄欖油均為化學(xué)純 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇、甘油、氯化鈉(NaCl)均為分析純 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;水為去離子水。

圖1 大豆卵磷脂與Span80的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of Lecithin and Span80注:a.大豆卵磷脂;b.Span80。

Vortex-Genie2渦漩混合儀 美國Scientific Industries公司;DDS-11A數(shù)顯電導(dǎo)率儀 上海雷磁新涇儀器有限公司;TECNAI 12型負染-透射電鏡 荷蘭Philip公司;DK-S22電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;KQ-50B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Barnstead Lab Tower EDI 15超純水儀 美國Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 擬三元相圖的繪制 固定大豆卵磷脂、Span80與無水乙醇的質(zhì)量比,混合均勻作為表面活性劑相。將橄欖油(油相)與表面活性劑相以一定質(zhì)量比(10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10)在具塞管中稱量,超聲3 min后,采用渦旋混合儀使溶液混合均勻。在恒溫水浴(25±0.1) ℃條件下,逐滴向混合液中加入水相溶液(純水;氯化鈉水溶液;甘油水溶液),當(dāng)體系由澄清透明變?yōu)闇啙釙r,記錄加入水相的質(zhì)量。計算轉(zhuǎn)變點下體系各相(表面活性劑相、油相及水相)所占總量的質(zhì)量百分數(shù),并由此確定轉(zhuǎn)變點在相圖中的位置。

1.2.2 HLB值的確定 將大豆卵磷脂和Span80按照質(zhì)量比分別為1∶3、1∶1、3∶1、7∶1復(fù)配成不同HLB值(分別為5.2、6.2、7.1、7.5)的混合表面活性劑。以無水乙醇為助表面活性劑,固定混合表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比為2∶1,采用1.2.1中水相滴定法制備微乳液并繪制擬三元相圖,根據(jù)微乳區(qū)域面積的大小確定混合表面活性劑的最佳HLB值。

1.2.3 Km值的確定 根據(jù)1.2.2 中確定的最佳HLB值,將大豆卵磷脂和Span80進行復(fù)配,并與無水乙醇按照質(zhì)量比(Km值)分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2進行混合,采用1.2.1中水相滴定法制備微乳液并繪制擬三元相圖,根據(jù)微乳區(qū)域面積大小確定合適的Km值。

1.2.4 鹽濃度對微乳體系相行為的影響 根據(jù)1.2.2、1.2.3中結(jié)果,固定表面活性劑相中大豆卵磷脂、Span80與無水乙醇的質(zhì)量比為3∶1∶2,以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mol/L的氯化鈉水溶液代替純水作為水相,采用1.2.1 中水相滴定法制備微乳液并繪制擬三元相圖,考察不同濃度鹽溶液對橄欖油微乳體系相行為的影響。

1.2.5 甘油含量對微乳體系相行為的影響 根據(jù)1.2.2、1.2.3中結(jié)果,固定表面活性劑相中大豆卵磷脂、Span80與無水乙醇的質(zhì)量比為3∶1∶2,以不同濃度甘油水溶液(w水∶w甘油=2∶1、1∶1、1∶2)代替純水作為水相,采用1.2.1 中水相滴定法制備微乳液并繪制擬三元相圖,考察甘油不同添加量對橄欖油微乳體系相行為的影響。

1.2.6 電導(dǎo)率的測定 將大豆卵磷脂、Span80、無水乙醇以質(zhì)量比3∶1∶2混合為表面活性劑相,并與橄欖油以9∶1質(zhì)量比進行混合。以甘油水溶液(w水∶w甘油=1∶1)為水相,在(25±0.1) ℃下,制備不同水相含量的大豆卵磷脂/Span80/橄欖油/乙醇/甘油/水微乳體系。采用電導(dǎo)率儀,在(25±0.1) ℃下,測定不同含量水相時,體系電導(dǎo)率的變化情況。

1.2.7 微乳液滴微觀形貌分析 將1.2.6中制備的微乳液樣品滴在31.0孔·cm-2具有Formvar膜的載網(wǎng)表面,吸附10 min后,滴加2%的磷鎢酸進行染色,燈光下烤干,采用負染-透射電鏡(加速電壓:120 kV,放大倍數(shù):×18500)觀察微乳液的微觀形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)三次,結(jié)果取其平均值。采用AutoCAD 2007軟件繪制擬三元相圖,并計算相圖中微乳區(qū)域面積的大小(AT,以微乳單相區(qū)面積所占總面積的百分比表示)。其他則采用Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄欖油/水微乳體系相行為分析

2.1.1 不同HLB值對微乳體系相行為的影響 理論上,單一表面活性劑較難滿足多組分體系的微乳化要求[14]。實驗發(fā)現(xiàn),大豆卵磷脂或Span80作為單一表面活性劑,均無法實現(xiàn)橄欖油的微乳化,而將兩者復(fù)配為不同HLB值的混合表面活性劑,以無水乙醇為助表面活性劑,可以不同程度地形成橄欖油微乳液。由此表明,復(fù)配表面活性劑的乳化效果優(yōu)于單一表面活性劑,這與已有研究結(jié)果一致[15-16]。

固定混合表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比(Km值)為2∶1,繪制擬三元相圖,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)大豆卵磷脂與Span80以質(zhì)量比分別為1∶3、1∶1、3∶1、7∶1進行復(fù)配時,根據(jù)質(zhì)量分數(shù)加和法[17]計算得到混合表面活性劑的HLB值(依次為5.2、6.2、7.1、7.5)。由圖2可以看出,隨著HLB值的增加,微乳區(qū)域面積呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(AT=4.5%、8.8%、14.6%、10.9%)。當(dāng)大豆卵磷脂與Span80的質(zhì)量比為3∶1時,HLB值達到7.1,此時形成微乳區(qū)域的面積最大。Span80分子中環(huán)氧原子和羥基中氧原子通過氫鍵與水及H3O+結(jié)合,使得該非離子表面活性劑帶有部分正電性[18]。若復(fù)配表面活性劑中Span80含量較高,易發(fā)生靜電相斥作用,不利于表面活性劑分子在界面的緊密排列。當(dāng)大豆卵磷脂與Span80以質(zhì)量比3∶1混合時,兩者親水基團發(fā)生靜電吸引作用,表面活性劑分子相互靠近的幾率增加,并在油水界面達到有效吸附,降低了界面張力。若進一步增加復(fù)配表面活性劑中大豆卵磷脂的含量(大豆卵磷脂與Span80的質(zhì)量比為7∶1),微乳區(qū)域面積開始減小,這可能是由于大豆卵磷脂分子體積較大,Span80在界面排列所受空間阻力較大,且大豆卵磷脂在油水界面的界面密度較低,導(dǎo)致其界面效力不高[19]。

圖2 不同HLB值時微乳體系擬三元相圖Fig.2 Pseudo-ternary phase diagram of microemulsion with different HLB注：陰影部分表示微乳單相區(qū),其他為多相區(qū)。

2.1.2 不同Km值對微乳體系相行為的影響 在微乳體系中加入短鏈醇或多元醇作為助表面活性劑,有助于改變界面膜的自發(fā)曲率,增加膜的彈性,破壞液晶相的穩(wěn)定性[20]。對食用油脂橄欖油進行微乳化,體系配方的安全性是考慮的重點,因此,以乙醇為助表面活性劑、大豆卵磷脂-Span80(HLB=7.1)為混合表面活性劑,改變Km值,繪制擬三元相圖,考察不同Km值對橄欖油微乳體系相行為的影響,結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出,改變表面活性劑與助表面活性劑的比例,即添加不同量的乙醇,對橄欖油微乳區(qū)域大小存在一定的影響。隨著Km值的減小(依次為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2),微乳區(qū)域面積(AT=13.1%、14.6%、5.2%、0)先略有增加后迅速減小,最終單相微乳區(qū)完全消失。其中,當(dāng)Km值為2∶1(即大豆卵磷脂、Span80、無水乙醇質(zhì)量比為3∶1∶2)時,所形成微乳區(qū)域的面積最大。原因可能是隨著乙醇含量的增加,乙醇逐漸滲透至表面活性劑界面膜中,增加了界面膜的彎曲彈性[1,20-21],促進了微乳液的形成。乙醇含量的繼續(xù)增加,使得微乳區(qū)域減小甚至消失,這與張佩華等[22]的研究結(jié)果一致。原因可能是表面活性劑相對含量減少,導(dǎo)致其在油水界面的密度下降,不足以維持較低的油/水界面張力[22],引起相界面穩(wěn)定性下降,微乳結(jié)構(gòu)破壞。

圖3 不同Km值時微乳體系擬三元相圖Fig.3 Pseudo-ternary phase diagram of microemulsion with different Km

2.1.3 鹽濃度對微乳體系相行為的影響 固定大豆卵磷脂、Span80與無水乙醇的質(zhì)量比為3∶1∶2,以不同濃度NaCl水溶液代替純水作為水相,對橄欖油進行微乳化,繪制擬三元相圖,并計算相圖中單相區(qū)域面積,結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 不同濃度NaCl時微乳體系擬三元相圖Fig.4 Pseudo-ternary phase diagram of microemulsion with different concentration of NaCl

由圖5可見,隨著NaCl濃度的增加,橄欖油微乳區(qū)域的面積先緩慢增加后迅速減小,且當(dāng)NaCl溶液濃度達到3 mol/L時,微乳區(qū)域面積達到最大。大豆卵磷脂是兩性離子表面活性劑,其極性頭基在膠束表面所占面積易受離子強度的影響。Abbasi等[23]研究發(fā)現(xiàn),隨著離子強度的增加,卵磷脂親水性頭基的極性以及在油/水界面所占面積均減少,從而有利于W/O型微乳液的形成。另外,由于無機鹽能夠中和離子型表面活性劑極性基團的電荷,壓縮雙電層,使電荷密度降低[24],因此,NaCl溶液濃度的適度增加有利于降低油水界面張力,促進微乳液的形成。然而,隨著NaCl濃度的繼續(xù)增加(CNaCl>4 mol/L),微乳區(qū)域面積則明顯減小,這可能是由于鹽濃度的大量增加,使得助表面活性劑分子從界面層發(fā)生“鹽析”作用,轉(zhuǎn)移進入油相[23,25],導(dǎo)致體系形成微乳液的能力下降,微乳區(qū)域面積減小。

圖5 微乳區(qū)域面積隨NaCl溶液濃度的變化Fig.5 Variation of microemulsion area with different concentrations of NaCl in aqueous phase

2.1.4 甘油含量對微乳體系相行為的影響 固定大豆卵磷脂、Span80與無水乙醇的質(zhì)量比為3∶1∶2,以甘油水溶液代替純水作為水相,對橄欖油進行微乳化,繪制擬三元相圖,結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出,增加水相中甘油的含量(w水∶w甘油=1∶0、2∶1、1∶1、1∶2),橄欖油微乳區(qū)域面積緩慢增加(AT=14.6%、17.3%、18.7%、21.2%)。尤其對于表面活性劑含量相對較高時,甘油含量的增加明顯增大了微乳體系對水相的增溶量。甘油作為助溶劑,能夠改變水溶液的物理化學(xué)性質(zhì),如密度、粘度、折射率及界面張力等[26]。Garti[27]、zhang[28]等研究得出了類似的結(jié)論,當(dāng)水相中加入甘油,能一定程度增強非離子表面活性劑形成微乳液的能力。另外,有研究者[29-30]發(fā)現(xiàn),甘油的加入可以提高乳液儲藏的穩(wěn)定性。我們認為,在橄欖油微乳體系中增加甘油含量,微乳區(qū)域能穩(wěn)定存在,主要是由于乙醇在增加界面膜流動性的同時,甘油由于不具有表面活性,主要存在于水相中[26-27],加強了表面活性劑親水基團與醇分子中羥基的結(jié)合,形成更穩(wěn)定的氫鍵,從而有利于微乳體系的穩(wěn)定。

圖6 添加不同量甘油時微乳體系擬三元相圖Fig.6 Variation of microemulsion area as a function of added glycerol in aqueous phase

2.2 微乳液電導(dǎo)率

電導(dǎo)率法是鑒別微乳液結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的一種有效方法,根據(jù)電導(dǎo)率數(shù)值,可以確定微乳液的連續(xù)相,進而判斷微乳液的結(jié)構(gòu)類型[31-32](W/O、雙連續(xù)B.C.、O/W)。將大豆卵磷脂、Span80與無水乙醇按照質(zhì)量比3∶1∶2混合為表面活性劑相,與橄欖油以質(zhì)量比9∶1進行混合,以甘油水溶液(w水∶w甘油=1∶1)為水相,制備不同水相含量的大豆卵磷脂/Span80/橄欖油/乙醇/甘油/水體系。考察不同含量水相條件下,體系電導(dǎo)率的變化情況,結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出,混合液(大豆卵磷脂/Span80/乙醇)的電導(dǎo)率不為零,這可能是由于大豆卵磷脂的等電點為6.7,混合液的pH約為6.0,溶液呈微酸性,當(dāng)水相含量為零時,兩性離子質(zhì)子化,溶液具有一定的導(dǎo)電性。當(dāng)水相含量較低(Φ=0～22 wt%)時,隨著水相含量的增加,微乳體系的電導(dǎo)率直線上升,這表明隨著水相的加入,W/O型微乳液滴發(fā)生腫脹,液滴間相互吸引,并發(fā)生粘性碰撞,在油連續(xù)相中形成通道,從而連接形成電導(dǎo)鏈[33]。當(dāng)水相含量進一步增加,體系電導(dǎo)率變化緩慢,并在Φ=25 wt%時,體系電導(dǎo)率達到最大值。這主要是由于微乳液滴粘性碰撞產(chǎn)生的水相通道擴大并連接,形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),體系處于油、水局部連續(xù)的過渡態(tài)中間結(jié)構(gòu)[34],即形成B.C.型微乳液。當(dāng)水相含量超過30wt%,體系電導(dǎo)率急劇下降,此時,體系出現(xiàn)渾濁(如圖8),處于相分離狀態(tài)。這可能是由于當(dāng)含水量超過臨界值,表面活性劑界面膜發(fā)生破壞,油、水兩相分離,界面張力增大,水分子間的相互作用和電荷傳遞受到阻礙,從而使體系電導(dǎo)率下降[35]。

圖7 體系電導(dǎo)率隨水相含量(Φ)的變化Fig.7 Electricity of the system as a function of aqueous phase weight content(Φ)

圖8 不同水相含量(Φ)時體系外觀Fig.8 System appearance at different aqueous phase weight content(Φ)

2.3 微乳液滴形貌分析

圖9為2.2中水相含量分別為15 wt%和25 wt%時大豆卵磷脂/Span80/橄欖油/乙醇/甘油/水微乳體系的負染-透射電鏡圖。由圖9可以看出,當(dāng)水相含量為15 wt%時,微乳液滴呈球形分布,粒徑大小在10～100 nm,進一步證明體系為W/O型微乳液。當(dāng)水相含量為25 wt%,體系呈相互交錯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),顯示出油相及水相的連續(xù)性,微乳液呈雙連續(xù)型結(jié)構(gòu)。

圖9 不同水相含量下橄欖油微乳體系的負染-透射電鏡圖Fig.9 Negative-stained TEM images of olive oil microemulsions with different weight content of aqueous phase注:a.水相含量15 wt%;b.水相含量25 wt%。

3 結(jié)論

通過擬三元相圖法,以大豆卵磷脂/Span80復(fù)配作為混合表面活性劑,以乙醇為助表面活性劑,構(gòu)建橄欖油微乳體系。考察大豆卵磷脂/Span80不同配比形成的HLB值、表面活性劑與助表面活性劑的比值(Km值)及水相中NaCl、甘油含量對微乳體系相行為的影響。結(jié)果表明:當(dāng)大豆卵磷脂/Span80質(zhì)量比為3∶1,表面活性劑與助表面活性劑的比值(Km值)為2∶1時,大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄欖油/水體系形成的微乳區(qū)間面積最大。甘油或少量鹽離子的加入,可以在一定程度上增大微乳單相區(qū)面積,但當(dāng)鹽濃度較高時,微乳區(qū)域面積則明顯減小。

通過電導(dǎo)率法、負染-透射電鏡探討大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄欖油/甘油/水微乳體系的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。當(dāng)水相(w水∶w甘油=1∶1)含量低于22wt%時,體系主要呈W/O型結(jié)構(gòu);當(dāng)水相含量繼續(xù)增加,體系逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡p連續(xù)型結(jié)構(gòu);水相含量超過30wt%后,體系開始發(fā)生相分離。