蔣盼若, 樓恩哲，趙智祥，徐炯楠，鄭曉菲，柯瑞君，陳佳玉

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

肺癌是世界范圍內(nèi)的一大健康問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年肺癌占所有惡性腫瘤發(fā)病率、死亡率首位，在男性惡性腫瘤中分別占比24.63%和29.49%。手術(shù)、放療和化療是肺癌治療的常用策略。然而，肺癌患者總是在晚期才被確診，肺癌的5年生存率為16%，其中小細(xì)胞肺癌的5年生存率僅為6%。因此，尋找一種能有效治療肺癌的藥物是非常必要和迫切的。

近年來，人們越來越認(rèn)識到草本植物和植物來源的藥物具有很強(qiáng)的抗腫瘤潛力[1,2]，如紫杉醇、伊立替康和依托泊苷均提取自美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于腫瘤治療的植物藥[3]。芹菜是食藥兩用植物中的一種，已被證明具有許多生物學(xué)和藥理學(xué)功能，如抗炎、抗氧化和抗微生物等[4]。目前已從芹菜中提取多種成分，其中芹菜素、木犀草素、金圣草黃素、香豆素以及多種聚乙炔和酞類化合物已被證明具有腫瘤抑制作用[5]。芹菜素是芹菜的主要成分，能夠抑制乳腺癌、皮膚癌、前列腺癌、消化道腫瘤和某些血液惡性腫瘤的生長[6]。芹菜中的聚乙炔對急性淋巴細(xì)胞白血病有抗增殖活性和抑制生長的作用[7]。芹菜薄壁細(xì)胞的初生壁主要由果膠多糖組成[8]，該芹菜多糖(polysaccharides from celery, PSC)在芹菜中占有很大的比重，但芹菜多糖對腫瘤，尤其是肺癌的作用及相關(guān)機(jī)制一直未引起關(guān)注。本研究探討了芹菜多糖是否為芹菜的生物活性成分，可否參與抑制肺癌細(xì)胞生長，并探索其潛在的分子機(jī)制，以期為肺癌治療新藥的發(fā)現(xiàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

4～5周齡C57BL/6 小鼠購于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；各PCR引物的合成由上海Sangon Biotech公司完成；AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒為美國BD公司產(chǎn)品；TRIzol和SuperScript? III First-Strand Synthesis System來自美國Invitrogen公司；TOSOH BIOS TSK - Gel G4000 SWXL柱(7.8×300 mm)源自日本TOSOH BIOS公司；Waters Alliance 2410 RI檢測器為美國Waters公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖于美國Sigma公司采購。

1.2 多糖的制備

粗多糖的分離和純化遵循先前文獻(xiàn)中描述的方法[9]。簡而言之，從超市購買新鮮芹菜，在80℃下用乙醇提取三次，提取時(shí)間為3 h，殘?jiān)?00℃下用水煎煮三次，提取時(shí)間為3 h(固液比，1∶40 g /ml)，3 000×g條件下離心10 min后，水提取物在60℃真空濃縮，用三倍體積乙醇處理，4℃冰箱中沉淀過夜。將沉淀物重新懸浮在水中，并用蒸餾水透析(滲透極限分子量為3.5 kD)，不可透析部分在-20℃冷凍，解凍后再次離心以除去不溶性物質(zhì)。重復(fù)凍融10次后，將上清液凍干，收獲粗多糖部分。將粗多糖(6%)溶于蒸餾水中，并將其裝載到DEAE - Sephadex A - 25柱( 90 cm×5 cm )上。用蒸餾水、0.3 mmol/L和0.5 mmol/L NaCl連續(xù)洗脫該柱，每次直至苯酚-硫酸法洗脫碳水化合物陽性反應(yīng)消失。收集 0.5 mmol/L NaCl洗脫部分，透析并凍干。將含有碳水化合物的餾分合并、透析、凍干，并進(jìn)一步應(yīng)用于Sephadex G - 100柱(100 cm×3.5 cm)上，以獲得純化的多糖；濃縮目標(biāo)餾分，再次透析并凍干。

用配有TOSOH BIOS TSK - Gel G4000 SWXL柱的Waters 515凝膠滲透色譜法測定芹菜多糖的分子量。該柱用0.1 mmol/L硝酸洗脫，并用標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖校準(zhǔn)，洗脫由Waters Alliance 2410 RI檢測器監(jiān)控。以D -葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，用苯酚-硫酸法定量碳水化合物；以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。按照上述方法對每個(gè)樣品分析三次。脂多糖(LPS)污染通過鱟阿米巴細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(limulus amebocytes lysate, LAL)試驗(yàn)進(jìn)行檢測。

1.3 肺癌腫瘤模型制備及用藥

取4～5周齡C57BL/6小鼠，每只小鼠腹股溝皮下注射2×107個(gè)Lewis肺癌細(xì)胞并隨機(jī)分成5組，每組10只。兩天后，分別灌胃0 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg和100 mg/kg芹菜多糖(藥物體積均為500 μl)，共用藥10 d。取腫瘤組織拍照并稱重。

1.4 小鼠免疫反應(yīng)的檢測

荷瘤小鼠給藥10 d后，取從眼球靜脈采集小鼠血液，用小鼠淋巴細(xì)胞分離液通過密度梯度離心法分離小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞。經(jīng)FITC-CD4+和PE-CD8+抗體染色后，用流式細(xì)胞儀分析小鼠外周血中CD4+和CD8+細(xì)胞的百分比。取鼠脾，置于滴加生理鹽水的無菌紗布上，用注射器柄研磨脾，獲取單個(gè)脾淋巴細(xì)胞。1 000 r/min離心5 min回收單個(gè)脾細(xì)胞，加入5 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后于冰上裂解5 min，1 000 r/min離心5 min以回收脾淋巴細(xì)胞，并經(jīng)5 ml生理鹽水清洗2次。1 000 r/min離心5 min回收細(xì)胞，利用Trizol提取淋巴細(xì)胞RNA。所提取的RNA經(jīng)Nano drop 2000定量后，采用SuperScript? III First-Strand Synthesis System逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin作為內(nèi)參，qPCR法分析IL - 2、IFN -γ和IL - 4 mRNA的水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 芹菜多糖的特性

紅外光譜和凝膠滲透色譜法的結(jié)果證實(shí)本實(shí)驗(yàn)組所提取的芹菜多糖的純度為82%，同時(shí)凝膠滲透色譜結(jié)果中出現(xiàn)兩個(gè)峰，表明芹菜多糖是一種不均一的多糖，該多糖的分子量為1.17×103kD。

2.2 芹菜多糖抑制肺癌的作用

將芹菜多糖以0、25、50、75、100 mg/kg的濃度灌胃荷Lewis瘤C57BL/6小鼠。結(jié)果顯示，與0劑量組相比，芹菜多糖以劑量依賴的方式抑制Lewis肺癌的生長(圖1)，表明芹菜多糖具有很強(qiáng)的抗肺癌作用。

Fig. 1 PSC inhibited lung cancer growthinvivo(n=10)

1： PBS treated group; 2-5： 25 mg/kg, 50 mg/kg, 75 mg/kg, 100 mg/kg of PSC treated group

2.3 芹菜多糖增強(qiáng)了小鼠的免疫反應(yīng)

有研究顯示，植物多糖在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面具有很強(qiáng)的活性[10]。為了研究芹菜多糖是否能調(diào)節(jié)小鼠的免疫反應(yīng)，我們分析了經(jīng)芹菜多糖(0 mg/kg或75 mg/kg)治療10 d后的小鼠外周血中CD4+和CD8+細(xì)胞的百分比。結(jié)果證實(shí)，小鼠外周血中CD4+和CD8+細(xì)胞經(jīng)芹菜多糖治療后都顯著增加，即芹菜多糖治療組小鼠的免疫應(yīng)答顯著增強(qiáng)(圖2)。此外，qPCR檢測結(jié)果顯示，25～100 mg/kg芹菜多糖治療組小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL - 2、IFN -γ和IL - 4的mRNA表達(dá)上調(diào)，且IL - 2、IFN -γ和IL - 4表達(dá)水平與用藥劑量有關(guān)，其中IL - 2和IFN -γ的升高水平明顯高于IL - 4，結(jié)果見圖2、表1。所有這些數(shù)據(jù)表明芹菜多糖可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)，尤其是細(xì)胞免疫，這可能有助于其發(fā)揮抗肺癌的功能。

Fig. 2 PSC up-regulated CD4+and CD8+cells in peripheral blood of mice(n=10)

*P**PvsPBS treated group

GroupIL-2/β-actinIFN-γ/β-actinIL-4/β-actinPBS0.44±0.030.56±0.020.65±0.0525 mg/kg PSC0.84±0.011.73±0.07??0.82±0.0450 mg/kg PSC1.28±0.05??2.62±0.10??1.05±0.09??75 mg/kg PSC1.90±0.09??3.05±0.14??1.29±0.14??100 mg/kg PSC2.72±0.17??3.43±0.12??1.51±0.11??

**P<0.01vsPBS treated group

3 討論

目前，已有一些植物多糖被證實(shí)具有抗腫瘤的活性并被應(yīng)用于臨床[10]。一些研究表明，藥用植物多糖的抗腫瘤作用主要是由于其免疫調(diào)節(jié)活性。一些藥用植物的多糖通過上調(diào)免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，增強(qiáng)免疫反應(yīng)[11]。已經(jīng)證明，當(dāng)歸和火棘多糖可以增加外周血細(xì)胞和脾細(xì)胞中CD4+細(xì)胞的百分比和CD4+/CD8+比率[12, 13]。此外，來自藥用植物的多糖也有助于細(xì)胞因子的增加。例如，當(dāng)歸和火棘多糖能夠增加外周血細(xì)胞和脾細(xì)胞中IL - 2的產(chǎn)生。諾尼果果汁中的多糖可以刺激TNF -γ、IL - 1和IL - 10的釋放，抑制肺癌生長，并提高肺癌小鼠的存活率[14]。最近，Chen等人報(bào)道羊棲菜多糖通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫反應(yīng)[15]，如上調(diào)腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL - 1和TNF -γ，增加脾細(xì)胞增殖，在肺癌中具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性。

芹菜是一種家喻戶曉的食藥兩用植物，包括水芹、旱芹、西芹三種，這三種芹菜功能相近，藥用以旱芹為佳，旱芹被稱為“藥芹”。芹菜富含豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、胡蘿卜素、B族維生素、鐵、鈣、磷、鐵、鈉、磷等，同時(shí)，有平肝清熱，涼血止血，祛風(fēng)利濕，除煩消腫，涼血止血，解毒宣肺，祛風(fēng)利濕，健胃利血、清腸利便、潤肺止咳、降低血壓、健腦鎮(zhèn)靜的功效，至今未發(fā)現(xiàn)芹菜有毒副作用。芹菜中含有多糖成份，但該多糖是否具有防治肺癌的作用及其潛在作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究提取和純化了芹菜多糖，并探討了該多糖對肺癌發(fā)生發(fā)展的作用和相關(guān)機(jī)制。研究結(jié)果表明，芹菜多糖可通過上調(diào)小鼠外周血中CD4+和CD8+細(xì)胞的百分比以及脾淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子IL - 2、IFN -γ和IL - 4水平來提高小鼠的免疫水平，尤其是細(xì)胞免疫水平，從而對肺癌Lewis細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的增殖進(jìn)行抑制。

芹菜培養(yǎng)條件要求不高，價(jià)格便宜。芹菜多糖成份在芹菜中占比較高，易提取和保存，能被患者所接受。因此，芹菜多糖抗肺癌生物功能及相關(guān)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，必將為其進(jìn)一步抗肺癌的臨床應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。