楊子鍵，黃君瑤，高燁飛，黃文吉，徐世磊，金晶晶，萬燁東，嚴 明，毛紅嬌，張 云△

(1. 紹興文理學院醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，浙江 紹興 312000；2. 杭州電子科技大學自動化學院生物醫(yī)學工程系，浙江 杭州 310018)

人工關節(jié)假體植入體內后經(jīng)過長期磨損、碰撞會產(chǎn)生大量的聚乙烯(polyethylene，PE)、鈦(titanium，Ti)和磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)等磨損顆粒，這些微米粒徑的細小顆?？杉せ罴袤w周圍單核/巨噬細胞、成纖維細胞和成骨細胞等組織細胞釋放腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，以上破骨細胞活化這些因子可誘導破骨細胞形成和假體周圍骨溶解，最終導致關節(jié)假體晚期松動及人工關節(jié)置換失敗[1, 2]。假體周圍除了含有上述組織細胞外，還存在著豐富的骨細胞(osteocyte)，其數(shù)量占骨組織細胞的90%～95%。以往研究和本室前期實驗結果表明磨損顆粒誘導假體周圍骨細胞損傷及凋亡[3, 4]，釋放 TNF-α、IL-1β和IL-6等因子，促進假體周圍炎癥性骨溶解[1, 2, 5]。因此，骨細胞在磨損顆粒誘導的假體周圍骨溶解中發(fā)揮重要的作用，是防治假體周圍骨溶解及關節(jié)松動的一種新的靶細胞。

有研究顯示雙膦酸鹽類藥物可抑制循環(huán)疲勞載荷誘導或骨質疏松大鼠尺骨或椎骨中骨細胞活性降低，減少骨細胞凋亡[6, 7]，阻止假體周圍骨溶解和關節(jié)松動。但是，雙磷酸鹽類藥物存在副作用多，不宜長期服用等缺點[8]。因此，尋找一種高效、毒副作用少，且能長期應用于阻止假體周圍骨細胞損傷和凋亡，減輕假體周圍骨溶解及關節(jié)松動的藥物已經(jīng)迫在眉睫。

佛手苷內酯(bergapten，BP，圖1)是從佛手、當歸和白芷等中藥材中提取的一種天然香豆素類化合物，目前已用于炎癥和腫瘤等方面的治療[9-11]。有研究證實佛手苷內酯能明顯促進成骨細胞增殖、分化及新骨形成[12]，誘導破骨細胞及其前體細胞凋亡而抑制骨吸收[13]，可用于治療骨折、骨軟化和骨質疏松癥。但是，佛手苷內酯對TCP磨損顆粒誘導的骨細胞損傷的影響如何，目前尚不明確。本研究構建TCP磨損顆粒誘導的小鼠骨細胞MLO-Y4損傷體外模型，觀察佛手苷內酯對TCP磨損顆粒誘導的骨細胞損傷及凋亡的影響，并闡明其可能作用機理，為佛手苷內酯用于防治假體周圍骨溶解和關節(jié)松動提供一種新的治療靶點。

Fig. 1 Chemical structure of bergapten (MW=216.19)

1 材料與方法

1.1 材料

TCP磨損顆粒由浙江大學化學系饋贈；小鼠骨細胞MLO-Y4由美國密蘇里大學口腔學院Bonewald教授饋贈。佛手苷內酯(HPLC≥95%)購自上海源葉生物科技有限公司；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和小牛血清(CS)購自美國Gibco公司；超敏ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術有限公司；Calcein-AM活體分子探針、MTT、TRIzol、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、RIPA裂解液和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；Applied BiosystemTMSYBRTM試劑購自美國ThermoFisher Scientific公司；兔抗GRP78抗體、兔抗PERK抗體、兔抗phospho-PERK(p-PERK)抗體、兔抗eIF2α抗體、兔抗phospho-eIF2α(p-eIF2α)抗體、兔抗ATF4抗體、兔抗CHOP抗體、兔抗caspase-3抗體和小鼠抗β-actin抗體購自美國Cell Signaling公司；PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2 骨細胞MLO-Y4的培養(yǎng)

第39代小鼠骨細胞MLO-Y4復蘇后加入含有2.5% FBS和 2.5%CS的α-MEM培養(yǎng)基中，置于37 °C、5% CO2及飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，24 h后換新的培養(yǎng)基。當細胞80%～85%鋪滿培養(yǎng)瓶底時加入0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA消化2～3 min進行傳代。

1.3 佛手苷內酯的毒性劑量研究

取骨細胞(1×104cells/ml)接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，加入佛手苷內脂(0.2 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L)孵育48 h后，加入MTT(5 mg/ml)溫室避光孵育4 h；棄上清液后，加入二甲基亞砜(DMSO，200 μl)溶解甲瓚；充分振搖后，置于酶標儀測定OD490nm和OD690nm，計算各組骨細胞的活性變化，確定佛手苷內脂的毒性劑量。

1.4 TCP磨損顆粒誘導骨細胞損傷模型的制備及分組

取骨細胞MLO-Y4(1×104cells/ml)接種于96孔、24孔或6孔培養(yǎng)板中孵育24 h后，傾去培養(yǎng)基，加入TCP磨損顆粒(0.1 mg/ml)繼續(xù)共孵育48 h建立骨細胞損傷體外模型。實驗分為正常對照(Control)組、TCP磨損顆粒(TCP，0.1 mg/ml)組、佛手苷內酯(1 μmol/L)組、佛手苷內酯(5 μmol/L)組和佛手苷內酯(20 μmol/L)組。

1.5 MTT法和Calcein-AM染色檢測細胞活性和形態(tài)的變化

取骨細胞(1×104cells/ml)接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，采用篩選出的佛手苷內脂有效干預劑量(1 μmol/L、5 μmol/L、20 μmol/L)預孵育4 h后，加入TCP磨損顆粒(0.1 mg/ml)后分別繼續(xù)孵育48 h。加入MTT(5 mg/ml)溫室避光孵育4 h；棄上清液后，加入二甲基亞砜(DMSO，200 μl)溶解甲瓚；充分振搖后，置于酶標儀測定OD490nm和OD690nm，計算各組骨細胞的活性變化。

1.6 Calcein-AM染色觀察骨細胞形態(tài)改變

取骨細胞(1×104cells/ml)接種于打孔皿中培養(yǎng)24 h，按照方法1.5處理。去除培養(yǎng)基后加入Calcein-AM(5 μmol/L)室溫避光孵育30 min，PBS清洗后置于激光共聚焦下觀察骨細胞形態(tài)和活性變化。

1.7 Hoechst3342染色觀察骨細胞凋亡

取骨細胞(1×104cells/ml)接種于打孔皿中培養(yǎng)24 h，按照方法1.5處理。去除培養(yǎng)基后加入Hoechst 33342染色液(5 μmol/L)室溫避光孵育5 min，PBS清洗2次后置于激光共聚焦下觀察骨細胞核染色質聚集、核碎裂及胞質濃縮等情況。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡

取骨細胞(1×104cells/ml)接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，按照方法1.5處理。然后通過消化獲取骨細胞，經(jīng)1 000 r/min離心10 min去除培養(yǎng)基，PBS清洗2次。 然后加入5 μl Annexin V-FITC/10 μl碘化丙啶(PI)，避光室溫37℃溫育15 min。最后加入200 μl PBS并混勻后上流式細胞儀檢測各組骨細胞凋亡情況。FITC的激發(fā)波長為488 nm，檢測發(fā)射波長575 nm。

1.9 實時熒光定量PCR檢測骨細胞特征蛋白的mRNA水平

取骨細胞(1×104cells/ml)接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，按照方法1.5處理。。然后加入TRIzol法提取總RNA，反轉錄后應用Applied BiosystemTMSYBRTM試劑盒進行熒光定量PCR檢測。設置程序：95℃ 5 min預變性，后以95℃ 30 s變性、56℃ 30 s退火、72℃ 40 s延伸等45個循環(huán)進行擴增，最后37℃ 30 s。導出擴增曲線，記錄Ct值，以mRNA水平以相對定量(GADPH)表示，應用2-△△Ct測定，引物序列見表1。

Tab. 1 Sequences of PCR primers

1.10 Western blot檢測PERK通路相關蛋白表達

取骨細胞(1×104cells/ml)接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，按照方法1.5處理。。去除培養(yǎng)基后，每孔加入RIPA裂解液(100 μl)冰上裂解30 min。經(jīng)13 000 r/min離心15 min上清液，利用BCA試劑盒檢測各組蛋白濃度。各組蛋白經(jīng)煮沸10 min，冷卻后每孔上樣30 μg蛋白，行12%SDS-PAGE分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉移到PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶常溫封閉2 h后，分別加入兔抗GRP78抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗PERK抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗p-PERK抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗eIF2α抗體和兔抗p-eIF2α抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗ATF4抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗CHOP抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗capase-3抗體(1∶1 000稀釋)和小鼠抗β-actin抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL顯色液；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白變化。

1.11 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 佛手苷內酯對TCP磨損顆粒誘導骨細胞活性改變的影響

MTT活性檢測結果顯示：佛手苷內酯濃度在1～20 μmol/L范圍內對正常骨細胞MLO-Y4無毒性作用，骨細胞活性變化不大(圖2A)。而佛手苷內酯(40 μmol/L)可明顯抑制MLO-Y4細胞增殖，細胞活性明顯降低，僅為Control組的64.07%。據(jù)此，本研究選取1 μmol/L、5 μmol/L和20 μmol/L為干預劑量。

MTT檢測和Calcein-AM染色結果表明：與Control組比較，TCP組骨細胞MLO-Y4活性顯著降低，偽足明顯減少，其細胞活性減少為Control組的 44.95%(圖2B、圖2C，P<0.05)；與TCP組比較，佛手苷內酯處理組骨細胞活性及偽足明顯增加，呈一定的劑量依賴性，細胞活性分別增加為TCP組1.04倍(1 μmol/L)、1.53倍(5 μmol/L)和2.19倍(20 μmol/L)(圖2B、圖2C，P<0.05)。

A, B: Cell viability measured by MTT;C： Representative morphology of MLO-Y4 cells (Calcein-AM, ×200); TCP: Tricalcium phosphate; MTT: Tartrate resistant acid phosphatase; BP: Bergapten

*Pvscontrol group;#PvsTCP group;△PvsBP (1 μmol/L) group;▲PvsBP (5 μmol/L) group

2.2 佛手苷內酯對TCP磨損顆粒誘導骨細胞凋亡的影響

流式細胞術定量檢測結果顯示：與Control組比較，TCP組骨細胞核染色質聚集、核碎裂及胞質濃縮等典型形態(tài)學改變，細胞膜外翻，凋亡率顯著增加為Control組的7.61倍(圖3、圖4，P<0.05)，并伴隨caspase-3的活化。與TCP組比較，佛手苷內酯組骨細胞凋亡及caspase-3的活化顯著減少，其凋亡率分別減少為TCP組的87.88%(1 μmol/L)、51.84%(5 μmol/L)和28.35%(20 μmol/L)(圖3、圖4，P<0.05)。

Fig. 3 Effects of bergapten on morphologic changes of apoptosis induced by TCP wear particles in osteocytes MLO-Y4 cells (Hoechst 33342, ×200)

TCP: Tricalcium phosphate; BP: Bergapten

A： FCM for apoptosis caused by TCP wear particles in osteocytes MLO-Y4; B： Casp-3 activation examined by western blot; C： The percentage of apoptosis analyzed; TCP: Tricalcium phosphate; BP: Bergapten

*Pvscontrol group;#PvsTCP group;△PvsBP (1 μmol/L) group;▲PvsBP (5 μmol/L) group

2.3 佛手苷內酯對TCP磨損顆粒誘導骨細胞功能損傷的影響

與Control組比較，TCP組骨細胞中DMP-1的RNA水平顯著減少，而SOST和FGF23的mRNA水平明顯增加，造成DMP-1/SOST減少(表2，P< 0.05)；與TCP組比較，佛手苷內酯組骨細胞中DMP-1的mRNA水平明顯增加，SOST和FGF23的mRNA水平明顯減少，造成DMP-1/SOST顯著增加(表2，P<0.05)。

Tab. 2 Effects of bergapten on dysfunctions of osteocytes caused by TCP wear particles in MLO-Y4 cells n=3)

TCP: Tricalcium phosphate; BP: Bergapten; DMP-1: Dentin matrix protein1; SOST: Sclerostin; FGF23: Fibroblast growth factor 23.

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTCP group;△P<0.05vsBP (1 μmol/L) group;▲P<0.05vsBP (5 μmol/L) group

2.4 佛手苷內酯對TCP磨損顆粒誘導骨細胞內質網(wǎng)應激反應及PERK通路活化的影響

Western blot檢測結果顯示：與Control組比較，TCP組骨細胞發(fā)生內質網(wǎng)應激反應及PERK信號通路被激活，表現(xiàn)為TCP組骨細胞中內質網(wǎng)應激標志蛋白質GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4和CHOP等蛋白質表達均明顯上調(P<0.05，圖5)，p-PERK/PERK和p-eIF2α/p-eIF2α值也明顯減少。與TCP組比較，佛手苷內酯組骨細胞中GRP78、ATF4和CHOP等蛋白質表達顯著下調、p-PERK/PERK和p-eIF2α/p-eIF2α值也明顯增加(P<0.05，圖5)，且佛手苷內酯對內質網(wǎng)應激反應和PERK通路的激活影響具有一定的劑量依賴性。

3 討論

人工關節(jié)置換術是指用人工關節(jié)置換和代替損傷或病損關節(jié)，是臨床治療晚期髖、膝關節(jié)等嚴重關節(jié)疾病的重要手段，它可有效減輕患者關節(jié)疼痛、恢復關節(jié)功能，提高患者生活質量。但是，隨著關節(jié)置換病例的增加和時間的延長，假體晚期松動問題日益突出。大量研究表明，PE、Ti和TCP等三類關節(jié)假體植入體內后，經(jīng)過長期磨損、碰撞產(chǎn)生大量的磨損顆粒，這些微米粒徑的細小顆粒聚集于假體表面會刺激假體周圍組織細胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2，以上破骨細胞活化這些因子可誘導破骨細胞形成和假體周圍骨溶解，最終導致關節(jié)假體晚期松動及人工關節(jié)置換失敗[1, 2]。

目前有關磨損顆粒對假體周圍巨噬細胞、成骨細胞和破骨細胞的影響研究較多，而對于假體周圍含量豐富的骨細胞在假體周圍骨溶解的作用研究還很少。2015年，Zawawi[14]研究團隊利用小鼠顱骨溶解模型證實PE磨損顆粒可誘導假體周圍骨細胞凋亡，與人工全髖關節(jié)翻修術假體周圍骨細胞損傷情況一致。最近我們前期實驗結果也顯示TCP磨損顆粒植入小鼠顱骨矢狀縫初期假體周圍骨細胞發(fā)生凋亡[4]，釋放TNF-α、IL-1β、SOST和RANKL從而促進破骨細胞活化與骨溶解，且假體周圍骨細胞凋亡先于破骨細胞的活化。另外，TCP磨損顆?？蓽p少假體周圍骨細胞特征蛋白DMP-1的mRNA水平，增加SOST和FGF23的mRNA水平。而DMP-1正調控骨代謝，其表達降低可抑制新骨形成而誘導骨吸收；而SOST和FGF23是一種負性調節(jié)骨量因子，SOST和FGF23的表達增加容易造成破骨細胞性骨溶解[15, 16]。因此，DMP-1、SOST和FGF23的mRNA水平以及DMP-1/SOST變化可反映骨細胞功能損傷情況。以上研究結果表明，骨細胞是誘導假體周圍骨溶解的重要啟動者，而阻止假體周圍骨細胞損傷及凋亡可防治磨損顆粒誘導假體周圍骨溶解和關節(jié)松動。

A: Activation of PERK/eIF2α signaling pathway examined by western blot; B, C, D, E and F: Densitometric analysis data;

GRP78: Glucose regulated protein 78; PERK: Phospho-protein kinase R-like ER kinase; p-PERK: Phospho-PERK; eIF2α: Eukaryotic initiation factor 2α; p-eIF2α: phospho-eIF2α; ATF4: Activating transcription factor 4; CHOP: C/EBP-homologous protein; TCP: Tricalcium phosphate; BP: Bergapten

*Pvscontrol group;#PvsTCP group;△PvsBP (1 μmol/L) group;▲PvsBP (5 μmol/L) group

佛手苷內酯是一種天然香豆素類化合物，具有抗炎和抗腫瘤等活性[9-11]，臨床上也常用于白癜風等皮膚病的治療。有報道顯示，佛手苷內酯可促進成骨細胞的增殖和分化，增加新骨形成；另有研究認為佛手苷內酯能誘導破骨細胞及其前體細胞凋亡，阻止破骨細胞生成和骨吸收[12, 13]。本研究結果顯示佛手苷內酯可顯著抑制TCP顆粒誘導的骨細胞MLO-Y4活性降低、減少細胞凋亡，上調DMP-1的mRNA水平，并下調SOST和FGF23的mRNA水平。這表明佛手苷內酯可通過抑制細胞凋亡來保護MLO-Y4細胞，使其免受TCP磨損顆粒的功能損傷。但是，其具體調控機制目前還不清楚。

眾多研究證實內質網(wǎng)應激參與調控骨細胞凋亡[17, 18]，調節(jié)骨吸收疾病的發(fā)生和發(fā)展。內質網(wǎng)作為真核細胞重要的細胞器，是細胞內脂質代謝及蛋白質合成后修飾和折疊的場所。缺氧、葡萄糖缺乏、蛋白轉運異常及Ca2+耗竭等病理刺激均可誘導未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網(wǎng)腔內大量堆積，引起內質網(wǎng)應激。內質網(wǎng)應激的調控包括PERK、肌醇需要酶-1( inositol-requiring enzyme 1，IRE1)和活化轉錄因子(activating transcription factor 6，AFT6)等3條信號通路[19-21]。其中，PERK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。正常情況下，PERK與內質網(wǎng)分子伴侶GRP78結合形成穩(wěn)定的復合物，處于無活性狀態(tài)。當發(fā)生ERS時，PERK與GRP78解離，解離后的PERK形成同源二聚體并發(fā)生自身磷酸化，活化的PERK使下游eIF2α發(fā)生磷酸化，抑制未折疊蛋白質合成，恢復內質網(wǎng)功能而促進細胞存活[22]。但是，當發(fā)生長時間過強的ERS時，磷酸化的eIF2α可通過上調其下游ATF4和CHOP表達而介導細胞凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)佛手苷內酯顯著減弱TCP磨損顆粒誘導的骨細胞內質網(wǎng)應激反應及PERK通路的活化，阻止骨細胞發(fā)生內質網(wǎng)應激性凋亡，表現(xiàn)為：與TCP組比較，內質網(wǎng)應激相關蛋白質GRP78、ATF4和CHOP的表達明顯下調，p-PERK/PERK值和p-eIF2α/p-eIF2α值顯著增加，與佛手苷內酯對骨細胞凋亡的抑制作用基本一致(圖4)。然而，另外兩條內質網(wǎng)應激通路IRE1和ATF6在佛手苷內酯阻止TCP磨損顆粒誘導的骨細胞損傷中所發(fā)揮的作用如何，還需要我們以后進行深入的探討。

綜上，佛手苷內酯可通過減輕TCP磨損顆粒誘導的內質網(wǎng)應激及PERK通路活化而阻止骨細胞凋亡。因此，佛手苷內酯有望成為防治假體周圍骨細胞損傷及骨溶解的一種潛在藥物。