韓 潔，田 蕾，劉子怡，方 振，襲著革△，劉曉華△

(1. 天津體育學(xué)院，天津 301617；2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050；3. 濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000)

納米材料由于其體積小、比表面積大，逐漸滲透于人們生活和生產(chǎn)的各個(gè)方面。納米氧化鋅顆粒(zinc oxide nanoparticles，ZnO NPs)是一種新型的金屬氧化物納米顆粒，一方面由于其高效的紫外線吸收性能，被廣泛應(yīng)用于化妝品和防曬霜中，另一方面由于具有抗菌特性，被用于食品工業(yè)添加劑和食品包裝，另外，它們還被用于農(nóng)業(yè)殺菌劑以及抗癌藥物等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1]。ZnO NPs可通過食品、食品包裝和藥物載體直接進(jìn)入人體，也可能通過食物鏈?zhǔn)剐孤队诃h(huán)境中的ZnO NPs被人體攝入。此外，一些通過呼吸進(jìn)入人體的納米顆粒還可以經(jīng)肺黏膜纖毛系統(tǒng)排出后，被吞入胃腸道[2]。通過胃腸道途徑進(jìn)入機(jī)體的ZnO NPs會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生哪些損傷效應(yīng)，成為科研工作者不得不考慮的問題。Esmaeillou[3]等報(bào)道ZnO NPs暴露5 d可損傷肝，腎和肺。Hong[4]等報(bào)道ZnO NPs可誘導(dǎo)肝臟組織損傷。 Kim[5]等報(bào)道口服不同大小粒徑的ZnO NPs 14 d可在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)免疫毒性。目前，關(guān)于ZnO NPs經(jīng)口灌胃暴露的毒性效應(yīng)研究已有報(bào)道，但是這些研究要么使用較高濃度的納米氧化鋅，要么暴露時(shí)間較短，并沒有低濃度長(zhǎng)期暴露的研究結(jié)果。本文主要探討食品或包裝中的納米氧化鋅對(duì)機(jī)體的毒性，因此，選擇使用濃度較低的ZnO NPs，及60 d 的暴露時(shí)間，分析其毒性靶器官，為今后食品行業(yè)使用ZnO NPs的用量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

ZnO NPs，白色粉末，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 99.9%，顆粒形態(tài)不規(guī)則，粒徑在20～80 nm之間(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司提供)，在4℃下，經(jīng)超聲儀處理30 min后，用生理鹽水配置成2 mg/ml的懸浮液。

血生化分析儀(C501，羅氏)，連續(xù)可見光譜酶標(biāo)儀(xMark Microplate Spectrophotometer，Bio-Rad)，炎癥因子PAF，IL-6和TNF-α檢測(cè)試劑盒酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(北京博奧拓達(dá))，10%甲醛固定液、無水乙醇、二甲苯和蘇木素-伊紅(HE)染液(Solarbio公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及染毒

10周齡雄性C57BL/6J小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)于一個(gè)環(huán)境控制室里，溫度保持在(21±1)℃，濕度在50%±5%，12 h的光照/12 h的黑暗循環(huán)，自由活動(dòng)，普通飼料，正常飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后納入實(shí)驗(yàn)。

20只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，實(shí)驗(yàn)組將ZnO NPs溶液以20 mg/kg體重的劑量連續(xù)灌胃染毒60 d，根據(jù)小鼠體重灌胃體積為0.2～0.3 ml,對(duì)照組除了使用生理鹽水代替ZnO NPs溶液外，其余條件均相同。

1.3 小鼠一般狀況觀察及體質(zhì)量測(cè)定

灌胃后每日觀察小鼠活動(dòng),飲食，皮毛，精神等狀況并做詳細(xì)的記錄。灌胃期間每周稱取體重，記錄小鼠每周的體重變化。

1.4 血液生化指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠經(jīng)眼球取血，室溫放置20 min后，將血液以3 000 r/min，4℃，離心10 min，收集上清液，于-80℃冷凍保存。利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血中總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin, ALB)、球蛋白(globulin, GLOB)、白蛋白/球蛋白比值(albumin/globulin ratio, A/G)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)、谷草/谷丙轉(zhuǎn)氨酶比值(aspartate transaminase/alanine transaminase ratio, AST/ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(creatinine, Crea)、尿酸(uric acid, UA)、血糖(blood glucose, GLU)、膽固醇(cholesterol, CHOL)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)。

1.5 血清炎性因子測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中PAF、IL-6和TNF-α水平，按照試劑盒操作步驟，用酶標(biāo)儀檢測(cè)待測(cè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品450 nm處的OD值。根據(jù)OD值和濃度據(jù)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各樣本濃度。

1.6 病理檢查

將小鼠麻醉后取心、肝、脾、肺、腎和小腸等組織，于4%的多聚甲醛溶液中固定，72 h常規(guī)沖洗，脫水透明，石蠟包埋，4～6 μm組織切片，60～65℃烤片 ,30 min 脫蠟，HE染色，封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組織的病理變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ZnO NPs經(jīng)口染毒對(duì)小鼠一般狀況及體重的影響

對(duì)照組小鼠精神狀況良好，飲食、活動(dòng)情況均正常，皮毛光亮，ZnO NPs灌胃60 d后，小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減弱，行動(dòng)遲緩，進(jìn)食飲水略減，皮毛疏松無光澤。每周體重監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重與對(duì)照組比較無顯著性差異(圖1)。

Fig. 1 Changes of body weight after exposure to ZnO NPs(n=10)

2.2 ZnO NPs經(jīng)口染毒對(duì)小鼠血糖、血脂的影響

ZnO NPs灌胃60 d后，小鼠血糖水平較對(duì)照組有升高趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而血液中CHOL、TG、HDL和LDL含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。

Fig. 2 Changes of blood glucose and blood lipids after exposure to ZnO NPs(n=10)

2.3 ZnO NPs經(jīng)口染毒對(duì)小鼠肝、腎功能的影響

ZnO NPs灌胃60 d后，染毒組血中ALB含量、A/G值、AST/ALT值和ALP活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，AST活性呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，提示存在肝功能異常。而染毒組血中UA和BUN含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05和P<0.01),提示此暴露模型可導(dǎo)致小鼠腎功能異常(表1)。

2.4 ZnO NPs經(jīng)口染毒對(duì)血清炎癥因子的影響

與對(duì)照組相比，ZnO NPs暴露60 d可導(dǎo)致小鼠血清中炎癥因子PAF、IL-6和TNF-α均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明經(jīng)口染毒未引起小鼠出現(xiàn)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)(表2)。

2.5 ZnO NPs經(jīng)口染毒對(duì)各臟器組織結(jié)構(gòu)的影響

心、肝、脾、肺、腎和小腸等組織切片經(jīng)HE染色后，利用光學(xué)顯微鏡觀察病理變化。結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，胞漿豐富，無變形或壞死，染毒組小鼠心肌部分區(qū)域出現(xiàn)渾濁腫脹，細(xì)胞核溶解、形狀不規(guī)律；對(duì)照組小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可見，肝細(xì)胞大小一致，排列有序，肝細(xì)胞無變性壞死，染毒組小鼠肝臟可見較輕的炎性病變,出現(xiàn)灶性或小灶性壞死，壞死的肝細(xì)胞有核溶解、核破裂及核濃縮的現(xiàn)象；對(duì)照組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)清晰，紅髓及白髓比例正常，染毒組小鼠可見脾色素沉著較少，脾臟紅髓顏色變淡，紅髓白髓界限不清晰；對(duì)照組小鼠肺組織中肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡上皮細(xì)胞無異型，無炎性改變，染毒組小鼠可見肺泡擴(kuò)張不均勻，肺泡壁增厚，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張，充血，出現(xiàn)輕或中度間質(zhì)性炎癥；小鼠經(jīng)ZnO NPs染毒60 d后，腎臟和小腸未見明顯的病理變化(圖3見彩圖頁Ⅱ)。

IndexesControlTreatmentTP(g/L)59.80±4.2860.08±4.14ALB(g/L)21.72±1.8425.28±2.22?GLB(g/L)38.08±3.5934.80±2.73A/G0.56±0.030.74±0.05??ALT(U/L)53.25±25.9144.60±6.69AST(U/L)97.75±35.98119.20±40.46AST/ALT1.72±0.432.63±0.62?ALP(U/L)108.80±28.10156.40±25.18?BUN(μmol/L)5.56±1.168.36±1.17??Crea(μmol/L)9.20±0.849.00±2.00UA(μmol/L)59.00±10.10152.00±52.18?

TP: Total Protein；ALB： Albumin；GLB： Globulin；A/G： Albumin/Globulin；ALT： Alanine aminotransferase；AST： Aspartate aminotransferase；AST/ALT： Aspartate aminotransferase/Alanine aminotransferase；ALP： Alkaline phosphatase；BUN: Blood urea nitrogen; Crea： Creatinine; UA: Uric acid

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

GroupPAF IL-6 TNF-αControl2.12±0.62115.54±29.48111.57±35.13Treatment1.92±0.33105.73±35.4697.18±51.33

PAF: Platelet activating factor; IL-6: Interleukin-6; TNF-α : Tumor necrosis factor-α

3 討論

越來越多的研究表明，納米顆?？蓪?duì)肝臟、腎臟和脾臟等組織產(chǎn)生毒性作用[6]。納米氧化鋅作為一種被廣泛使用的納米顆粒物，已證實(shí)對(duì)多種細(xì)胞，如人肺上皮細(xì)胞[7]、胚胎肺成纖維細(xì)胞[8]和支氣管上皮細(xì)胞[9]等產(chǎn)生損傷作用。鑒于ZnO NPs在化妝品、食品工業(yè)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，其經(jīng)胃腸途徑進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生的毒性效應(yīng)成為必須關(guān)注的問題。目前，關(guān)于ZnO NPs經(jīng)口暴露的毒性評(píng)價(jià)研究尚未廣泛開展，現(xiàn)有的研究存在納米氧化鋅使用濃度較高，或暴露時(shí)間較短的問題，缺乏低濃度、長(zhǎng)期暴露的毒性評(píng)價(jià)結(jié)果。因此，本文選擇將ZnO NPs以灌胃方式，采用20 mg/kg體重的染毒劑量和60 d染毒時(shí)間，觀察經(jīng)口染毒對(duì)小鼠外周臟器的影響。

染毒組灌胃60 d后，小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減弱，行動(dòng)遲緩，進(jìn)食飲水略減，皮毛疏松無光澤。李慧民[10]等研究發(fā)現(xiàn)，40、80/160 mg/kg連續(xù)灌胃90 d可導(dǎo)致染毒組小鼠活動(dòng)較少，有個(gè)別小鼠出現(xiàn)弓背、豎毛并出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,其可能與過量的納米粒子進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞毒性有關(guān)，其作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。據(jù)美國衛(wèi)生部報(bào)道，在人體內(nèi)，攝入高水平的鋅幾個(gè)月會(huì)降低HDL膽固醇的水平，本實(shí)驗(yàn)中CHOL、TG、HDL和LDL含量均下降，但都無顯著性變化，Kim[11]等研究表明，100 nm ZnO NPs 經(jīng)口染毒90 d,500 mg/kg劑量可導(dǎo)致大鼠血糖和血清TG、TC顯著降低,可能是本實(shí)驗(yàn)ZnO NPs濃度低尚未引起小鼠脂質(zhì)代謝失衡。此外，通過對(duì)血清炎癥因子PAF、IL-6和TNF-α的測(cè)定來評(píng)價(jià)ZnO NPs的免疫毒性，發(fā)現(xiàn)都有下降的趨勢(shì)，但是并無顯著性差異, Ansar S[12]等研究發(fā)現(xiàn)，600 mg/kg ZnO NPs連續(xù)灌胃7 d可導(dǎo)致IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著上升，低劑量ZnO NPs慢性口服暴露可能不會(huì)引起免疫毒性。

Ben-Slama[13]等研究發(fā)現(xiàn)，10 mg/kg ZnO NPs連續(xù)灌胃5 d可導(dǎo)致雄性大鼠AST和ALT活性顯著升高。Abbasalipourkabir[14]等研究發(fā)現(xiàn)，每日腹腔注射50、100/150、和200 mg/kg ZnO 10 d可顯著增加AST活性,注射150和200 mg/kg ZnO 10 d可顯著增加ALT活性。在本實(shí)驗(yàn)中，染毒組血中AST活性具有升高趨勢(shì)，盡管與對(duì)照組相比差異無顯著性，但結(jié)合AST/ALT的比值以及ALP活性顯著升高，提示存在肝功能異常，Almansour[15]等研究發(fā)現(xiàn)，2 mg/kg ZnO NPs腹腔注射21 d可導(dǎo)致肝組織出現(xiàn)炎癥，水腫變性等現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)在肝臟中發(fā)現(xiàn)炎癥病變等病理變化也證實(shí)存在局部肝損傷，但本研究中采用的染毒方式并未誘導(dǎo)嚴(yán)重的肝損傷和肝功能紊亂。Kong[16]等研究也發(fā)現(xiàn)，40 mg/kg ZnO NPs經(jīng)口染毒90 d可導(dǎo)致小鼠血中AST和ALT活性升高，但與對(duì)照組相比差異不顯著性，而從80 mg/kg染毒劑量開始，這兩個(gè)指標(biāo)顯著升高。提示ZnO NPs染毒濃度是影響肝功能的因素之一。另外，染毒組血中ALB含量和A/G比值顯著升高，GLB含量有下降趨勢(shì)，提示可能存在肝臟代償合成白蛋白增加，而球蛋白消耗增加。我們認(rèn)為，以上的結(jié)果可能與長(zhǎng)期暴露導(dǎo)致肝臟的功能代償及機(jī)體處于慢性應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，染毒組小鼠血中UA和BUN含量顯著升高，表明存在腎功能障礙，但并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理結(jié)構(gòu)異常，提示本模型中ZnO NPs所致的腎損傷是功能性的。Wang[17]等發(fā)現(xiàn)，300和400 mg/kg ZnO NPs 灌胃14 d也可導(dǎo)致小鼠血中UA升高。

本研究發(fā)現(xiàn)，20 mg/kg ZnO NPs經(jīng)口灌胃60 d可導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)間質(zhì)性炎癥，脾臟色素沉著較少，紅髓顏色變淡，脾臟白色髓質(zhì)增多，心肌部分區(qū)域出現(xiàn)混濁腫脹的病理變化。這些發(fā)現(xiàn)在其他不同濃度ZnO NPs染毒的嚙齒類動(dòng)物中得到驗(yàn)證。Esmaeillou[3]等以333.33 mg/kg ZnO NPs給大鼠連續(xù)灌胃5 d，發(fā)現(xiàn)肺組織出現(xiàn)漿液性炎癥、肺泡嚴(yán)重充血、肺水腫等病理變化。Wang[18]等以5 g/kg ZnO NPs急性經(jīng)口染毒14 d，發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致脾臟腫大。HC[19]等以1.1和4.9 mg/m3ZnO NPs吸入暴露7 d，發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致SD大鼠心臟出現(xiàn)炎癥和纖維化，暴露30 d后心肌出現(xiàn)變性和壞死。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)腸組織進(jìn)行病理檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)異常，吳城[20]等研究發(fā)現(xiàn)，以960 mg/kg口服染毒ZnO NPs使得小鼠腸黏膜出現(xiàn)上皮細(xì)胞萎縮等癥狀，可能是本實(shí)驗(yàn)ZnO NPs劑量低尚未引起腸出現(xiàn)損傷。

綜上所述，ZnO NPs灌胃染毒60 d未引起C57BL/6J小鼠出現(xiàn)系統(tǒng)性炎癥，但可誘導(dǎo)心臟、肝臟、脾臟和肺臟出現(xiàn)輕度的病理變化，并導(dǎo)致肝功能和腎功能異常。因此，隨著ZnO NPs等納米材料的廣泛應(yīng)用，了解納米材料對(duì)機(jī)體的毒性效應(yīng)，對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)成為納米科學(xué)領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容。