張其良, 曹文理, 鄧全軍

(1. 天津市第四中心醫(yī)院消化內(nèi)科，天津 300140；2. 天津市北辰醫(yī)院呼吸內(nèi)科，天津 300400；3. 武警特色醫(yī)學(xué)中心，天津 300162)

在我國，食管癌是一種較常見的消化道惡性腫瘤，預(yù)后差，并且近幾年食管癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年升高的趨勢[1,2]。食管癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲力是影響患者療效以及預(yù)后的的一個(gè)重要因素，其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制目前仍不太明確。蛋白酶激活受體-2(proteinase-actived receptors 2，PAR-2)屬于細(xì)胞膜表面受體，廣泛分布于體內(nèi)多種組織和器官中，胰蛋白酶、類胰蛋白酶、凝血因子等是該受體的天然激動(dòng)劑，SLIGKV為其人工合成的有效的激動(dòng)劑。PRA-2激活后參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、影響腫瘤細(xì)胞的存活、生長、侵襲轉(zhuǎn)移以及瘤體新生血管的形成；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1(extracellular regulated protein kinase1, ERK1)通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中的一個(gè)重要通路而MAPK是PAR-2下游的一個(gè)重要信號通路，因此我們可得出推論：ERK1信號通路在人類惡性腫瘤細(xì)胞的生長和預(yù)后中扮演重要角色；CyclinD1蛋白在細(xì)胞周期中起到正向調(diào)控作用，如果相關(guān)基因被激活后導(dǎo)致CyclinD1蛋白持續(xù)高表達(dá)，這將會(huì)使細(xì)胞周期的G1期顯著縮短，提前進(jìn)入S期，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，形成腫瘤[3-5]。本課題組前期已成功構(gòu)建了穩(wěn)定的PAR-2 shRNA食管癌EC109細(xì)胞系，運(yùn)用MTT、流式細(xì)胞和Transwell小室方法檢測發(fā)現(xiàn)：激活PAR-2后，食管癌細(xì)胞EC109的增殖力和侵襲遷移力增強(qiáng)；靶向沉默PAR-2后，食管癌細(xì)胞EC109的增殖力和侵襲遷移力均受到負(fù)向影響[6-8]。本實(shí)驗(yàn)此次進(jìn)一步探討在食管癌細(xì)胞EC109的增殖過程中PAR-2是否可通過調(diào)節(jié)其下游MAPK通路(ERK1)進(jìn)而調(diào)節(jié)CyclinD1的表達(dá)從而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

PAR-2基因表達(dá)下調(diào)的人食管癌穩(wěn)定細(xì)胞株 PAR-2 shRNA EC109(前期穩(wěn)定轉(zhuǎn)染獲得)；RPMI1640 培養(yǎng)基購GIBCO公司；FBS(胎牛血清)購自PAN公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自天根公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根公司；RT-PCR試劑盒購自天根公司；β-actin抗體購自北京中杉公司；PAR-2、ERK1/2、p-ERK1/2、 CyclinD1一抗及二抗購自武漢博士德公司；PAR-2激動(dòng)劑SLIGKV、反激動(dòng)劑VKGILS及PD98059購自APEXPIO公司；β-actin、PAR-2、ERK1、CyclinD1基因PCR引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

選用含10%FBS(PAR-2 shRNA EC109細(xì)胞另含0．2 μg/ml的G418)的1640培養(yǎng)基，置于孵育箱中培養(yǎng)(孵育條件：37℃，5%CO2)，細(xì)胞貼壁生長，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。分組設(shè)計(jì)：(1)空白對照組：未經(jīng)任何處置的EC109細(xì)胞；(2)PAR-2激動(dòng)組：加入50 nmol/LPAR-2激動(dòng)劑(SLIGKV)的EC109細(xì)胞；(3)PAR-2反激動(dòng)組：加入50 nmol/LPAR-2反激動(dòng)劑(VKGILS)的EC109細(xì)胞；(4)PAR-2 shRNA組：PAR-2shRNA成功轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)；(5)MAPK抑制組：加入50 μmol/L MAPK阻滯劑( PD98059)預(yù)處理1 h后，加入50 nmol/L SLIGKV；以6×104cells/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于孵育箱中培養(yǎng)24 h后使用PBS清洗3次，更換為無血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后各實(shí)驗(yàn)組按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入所需試劑，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測PAR-2、ERK1、CyclinD1的mRNA的表達(dá)水平和PAR-2、ERK1、p-ERK1、CyclinD1的蛋白表達(dá)水平。

1.3 RT-PCR方法檢測基因表達(dá)

各組細(xì)胞祛除廢棄培養(yǎng)基后使用PBS清洗3次，加入350 μl的裂解液RL，反復(fù)吹打使細(xì)胞完全裂解，取細(xì)胞懸液移至RNase-Free 離心管中混勻。將混勻后的細(xì)胞懸液加入過濾柱，移至RNase-Free 離心管，12 000 r/min離心2 min，然后將1倍體積的乙醇混入濾液中后再次加入吸附柱，同上高速離心2 min，棄掉上層廢液后加入350 μl去蛋白液，高速離心2 min，棄廢液；加入80 μl DNase l工作液，室溫靜置15 min再次加入去蛋白液，同上；加入500 μl漂洗液，室溫靜置2 min，同上高速離心2 min，棄廢液(此步驟重復(fù)2次)；將吸附柱放入新的RNase-Free 離心管中，加入40 μl的RNase-Free ddH2O，同上高速離心2 min，得到RNA溶液。對RNA溶液進(jìn)行吸光度檢測，采用OD260/OD280的比值在1.8～2.0之間的RNA溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按產(chǎn)品說明書配制混合液；設(shè)置擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火/延伸32 s；40個(gè)循環(huán)60℃檢測熒光信號。上述設(shè)置完成后，把加入反應(yīng)液的96孔板置入PikoReal Real-time PCR儀進(jìn)行檢測。采用相對定量檢測目的基因和內(nèi)參基因，以 2-△△Ct來表示各基因的表達(dá)量(△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct處理組-△Ct對照組)。

1.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)

(1)蛋白提取：各組細(xì)胞去掉廢棄培養(yǎng)液，使用提前預(yù)冷的PBS(4℃)對細(xì)胞貼壁細(xì)胞進(jìn)行清洗(2遍)。于冰上進(jìn)行操作，每瓶細(xì)胞加400l含PMSF(100 mmol/L)的裂解液(RIPA完全裂解液)裂解60 min；高速離心，上清液即為蛋白提取液。按BCA試劑盒說明配制0.5 mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣本蛋白濃度。(2)SDS-PAGE電泳：根據(jù)測得的總蛋白濃度，每例標(biāo)本取總蛋白30 μg，5 % SDS-PAGE 80 V電泳30 min；12% SDS-PAGE 120 V電泳90 min，然后采用半干法轉(zhuǎn)印于PVDF膜上。(3)封閉：用5%的脫脂奶粉室溫振搖封閉1 h。(4)孵一抗：用抗體稀釋液(2%脫脂奶粉) 1∶200稀釋一抗，4℃冰箱孵育16 h；1×TBST 液洗膜3次,每次10 min。(5)孵二抗：同樣方法, 1∶2 000 稀釋二抗，室溫孵育1 h，1 ×TBST 液洗膜3次，每次10 min，然后放入1 ×TBS中。(6)顯影：加ECL顯影液，顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR方法檢測基因表達(dá)結(jié)果

與空白對照組相比較：PAR-2激動(dòng)組PAR-2 mRNA的表達(dá)量是其2.651倍(P<0.05)，PAR-2 shRNA組PAR-2 mRNA的表達(dá)量是其0.385倍(P<0.05)，MAPK抑制組中PAR-2 mRNA的表達(dá)量與其無明顯差異(P>0.05)；PAR-2激動(dòng)組ERK1 mRNA的表達(dá)量是其2.580倍(P<0.05),PAR-2 shRNA組ERK1 mRNA的表達(dá)量是其0.376倍(P<0.05)，MAPK抑制組 ERK1 mRNA的表達(dá)量是其0.497倍(P< 0.05)；與空白對照組相比較，PAR-2激動(dòng)組CyclinD1 mRNA的表達(dá)量是其2.012倍(P<0.05),PAR-2 shRNA組CyclinD1 mRNA的表達(dá)量是其0.318倍(P<0.05)，MAPK抑制組 CyclinD1 mRNA的表達(dá)量是其0.422倍(P<0.05)；與空白對照組相比較，PAR-2反激動(dòng)組的PAR-2 mRNA、ERK1 mRNA及CyclinD1 mRNA的表達(dá)均未見明顯改變(P>0.05，圖1)。

Fig. 1 The expression levels of PAR-2,ERK1 and CyclinD1 mRNA in each group

1: Blank group; 2: Excited group; 3: Anti excited group; 4: Transfected group; 5: MAPK Inhibition group

2.2 Western blot檢測蛋白表達(dá)結(jié)果

與空白對照組相比較，PAR-2激動(dòng)組PAR-2蛋白、p-ERK1蛋白以及CyclinD1蛋白的表達(dá)量均升高(P<0.05)；與空白對照組相比較，PAR-2 shRNA組PAR-2蛋白、p-ERK1蛋白以及CyclinD1蛋白的表達(dá)量均降低(P<0.05)；與空白對照組相比較，MAPK抑制組p-ERK1蛋白、CyclinD1蛋白的表達(dá)量均降低(P<0.05)；與空白對照組相比較，PAR-2反激動(dòng)組PAR-2、p-ERK1、CyclinD1蛋白的表達(dá)量未見明顯差異(P<0.05)；ERK1在各組中表達(dá)無明顯差異(P>0.05，圖2)。

Fig. 2 The expression levels of PAR-2,ERK1, p-ERK1 and CyclinD1 proteins in each group

1: Blank group; 2: Excited group; 3: Anti excited group; 4: Transfected group; 5: MAPK Inhibition group

3 討論

PARs存在于細(xì)胞膜表面，其為G蛋白偶聯(lián)受體，屬于七次跨膜單位的受體家族(GPCRs)中的一員，其中PAR-2為胰蛋白酶細(xì)胞表面受體，被胰蛋白酶激活參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，影響腫瘤細(xì)胞的存活、生長、侵襲轉(zhuǎn)移以及瘤體新生血管的形成[3]。編碼PAR-2的基因位于染色體5ql3，包括2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子[9]。PAR-2可被人體內(nèi)多種內(nèi)源性物質(zhì)如胰蛋白酶、凝血因子TF/Ⅶa復(fù)合物、Xa、類胰蛋白酶、纖溶酶等激活[10]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是PARs下游的一個(gè)重要信號通路，其中ERK1/2更是主要通路中的主要通路，其主導(dǎo)的細(xì)胞促有絲分裂和抗凋亡信號在人類惡性腫瘤細(xì)胞的生長和預(yù)后中扮演重要角色。在肝癌細(xì)胞中，PAR-2通過影響ERK1/AP-1途徑、Ca2+信號途徑，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[11-13]。本實(shí)驗(yàn)組前期研究發(fā)現(xiàn)PAR-2活化可通過增加MMP-2表達(dá)促進(jìn)人胰腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[14]，同時(shí)Ungefroren H等研究在發(fā)現(xiàn)胰腺癌中PAR-2高表達(dá)后可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)的表達(dá)，從而誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲[15]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RT-PCR的方法檢測PAR-2激動(dòng)后，ERK1 mRNA的表達(dá)較空白對照組表達(dá)增高，而PAR-2 shRNA組和MAPK通路抑制組ERK1 mRNA的表達(dá)較空白對照組表達(dá)減少；運(yùn)用Western blot的方法檢測PAR-2激動(dòng)后，ERK1蛋白的表達(dá)在各組中未見明顯改變，而p-ERK1蛋白在PAR-2激動(dòng)組的表達(dá)量高于空白對照組，p-ERK1蛋白在 PAR-2 shRNA組和MAPK抑制組表達(dá)低于較空白對照組。我們可以推測，在食管癌細(xì)胞EC109中，PAR-2激動(dòng)后可以增加ERK1基因的表達(dá)，但是ERK1蛋白并沒有增加，而p-ERK1蛋白表達(dá)在PAR-2激動(dòng)后表達(dá)增加。

細(xì)胞由前一次有絲分裂進(jìn)入的下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的連續(xù)動(dòng)態(tài)增殖過程稱為正常細(xì)胞周期，包括G1、S、G2和M期。CyclinD1蛋白在細(xì)胞周期中起到正向調(diào)控作用，在正常生理狀態(tài)下細(xì)胞進(jìn)人S期后CyclinD1蛋白會(huì)迅速分解，保證細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。CyclinD1蛋白與cdk4、cdk6結(jié)合，使Rb蛋白磷酸化，進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子E2F等游離出來并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，使細(xì)胞進(jìn)入S期，合成DNA，從而使細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)；如果相關(guān)基因被激活后導(dǎo)致CyclinD1蛋白持續(xù)高表達(dá)，這將會(huì)顯著縮短G1期，致使細(xì)胞周期提前進(jìn)入S期，使細(xì)胞增殖失控，形成腫瘤[4,5,16-18]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：在PAR-2激動(dòng)組中，CyclinD1 mRNA和CyclinD1蛋白的表達(dá)相比較于空白組均增高，而在PAR-2 shRNA組和MAPK抑制組，CyclinD1 mRNA和CyclinD1蛋白的表達(dá)相比較于空白組均減少，提示在食管癌細(xì)胞EC109中，激活PAR-2后可以通過MAPK ERK1通路上調(diào)CyclinD1在基因和蛋白層次的表達(dá)，從而加速食管癌細(xì)胞細(xì)胞EC109的增殖。

綜上所述，我們的研究表明：(1)在食管癌細(xì)胞EC109中，PAR-2激動(dòng)后，可以使其下游通路中ERK1基因及p-ERK1蛋白的表達(dá)增加，從而加速食管癌細(xì)胞EC109的細(xì)胞周期進(jìn)程，促使其增殖加速；反之，PAR-2抑制后，可以使其下游通路中ERK1基因及p-ERK1蛋白的表達(dá)降低，從而減緩食管癌細(xì)胞EC109的細(xì)胞周期進(jìn)程，促使其增殖變慢。(2)PAR-2激動(dòng)后，可以通過上調(diào)其下游通路中MAPK ERK1從而上調(diào)CyclinD1 mRNA和CyclinD1蛋白的表達(dá)，加快細(xì)胞周期，促進(jìn)食管癌細(xì)胞EC109的增殖；反之，PAR-2抑制后可以通過下調(diào)其下游通路中MAPK ERK1從而下調(diào)CyclinD1 mRNA和CyclinD1蛋白的表達(dá)從而減緩食管癌細(xì)胞EC109的細(xì)胞周期進(jìn)程，促使其增殖變慢。(3)在食管癌細(xì)胞EC109細(xì)胞中MAPK ERK1為PAR-2調(diào)節(jié)CyclinD1的中間通路，PAR-2激活或抑制后，MAPK ERK1的表達(dá)隨之改變，從而影響CyclinD1表達(dá)量，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，參與食管癌細(xì)胞EC109細(xì)胞增殖的調(diào)控。但CyclinD1在食管癌細(xì)胞EC109中是否也被其他通路調(diào)節(jié)、又有哪些通路參與CyclinD1的調(diào)節(jié)，以及通路中ERK1蛋白、p-ERK1蛋白表達(dá)存在差異這些問題目前仍不太明確，下一步我們將繼續(xù)深入研究。