李永豐， 任 維， 劉一輝

(陜西師范大學現(xiàn)代教學技術教育部重點實驗室， 陜西 西安 710062)

神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病直接造成的病理性疼痛[1]，機械觸誘發(fā)痛和痛覺過敏是主要的臨床特征性表現(xiàn)[2]。神經(jīng)病理性疼痛在普通人群中發(fā)病率為3.3%～8.2%，且病痛時期長，給患者帶來嚴重的經(jīng)濟負擔和心理應激[3]。近年來研究者對疼痛做了深入的研究，但外周損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛研究較少，尤其是外周神經(jīng)系統(tǒng)和運動功能密切相關，疼痛經(jīng)常使患者喪失勞動力，因此對外周鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的研究非常重要。

大麻素(cannabinoids,CB)具有強烈的鎮(zhèn)痛作用，主要通過激活CB1或CB2受體等發(fā)揮作用，其中CB1受體廣泛表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)和外周神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)，尤其是感覺神經(jīng)纖維上[4]，同時CB1受體也表達于外周的組織中[5]。臨床研究證明激活CB1受體具有顯著鎮(zhèn)痛作用[6]，但由于大麻是精神類成癮藥物，所以其使用受限[7]。不跨越血腦屏障而在外周損傷區(qū)局部注射CB1受體的激動劑也表現(xiàn)出強烈的鎮(zhèn)痛作用[8]。然而關于CB1受體在外周損傷區(qū)的鎮(zhèn)痛機制，目前還未見相關報道。

坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(chronic constriction injury，CCI)模型[9]是一個經(jīng)典的神經(jīng)病理性疼痛模型。該模型產生疼痛的主要原因是物質的運輸及代謝途徑受到影響，損傷區(qū)近端的終球處聚集多種離子通道，形成神經(jīng)瘤(起步點)，使得終球膜結構異于正常的神經(jīng)纖維膜而表現(xiàn)出超常的興奮性，產生節(jié)律豐富的自發(fā)放電，表現(xiàn)出痛覺過敏、痛覺異常、持續(xù)性疼痛等癥狀。這些癥狀的出現(xiàn)與損傷區(qū)自發(fā)放電密切相關。初級感覺神經(jīng)元產生自發(fā)放電即異位沖動，不僅是早期急性痛的重要原因，并且這些異位放電不斷轟擊脊髓背角等中樞部位，誘發(fā)產生脊髓背角長時程增強(long-term potentiation，LTP)等中樞敏化現(xiàn)象[10]。中樞敏化和下行易化系統(tǒng)的激活在神經(jīng)病理疼痛后期維持中起到重要作用[11]，因此對起步點的研究十分重要。鉀離子通道在調節(jié)細胞(尤其是末梢神經(jīng)細胞)的膜電位和興奮性中起著重要作用，其結構或功能狀態(tài)與起步點的形成以及疼痛的發(fā)生和發(fā)展有密切的關系[12]。在背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)中CB1受體和KV1.4在傷害性感受器神經(jīng)元上幾乎完全重疊，表明CB1受體和KV1.4的功能之間存在緊密的聯(lián)系。內源性大麻素直接參與鉀離子活動的調節(jié)[13]，內源性大麻素發(fā)揮作用與鉀離子之間存在密切的關系[14]，均說明CB1受體發(fā)揮作用與鉀離子通道密切相關。本研究探討CB1受體激活在外周發(fā)揮的鎮(zhèn)痛作用是否與鉀通道有關，以便進一步了解CB1受體在外周損傷區(qū)的鎮(zhèn)痛機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料及主要儀器

成年C57BL/6J 小鼠(8～16周，體重約23～30 g)由陜西師范大學現(xiàn)代教學技術教育部重點實驗室SPF級清潔動物房提供，購自西安交通大學動物中心，許可證編號為SCXK(陜)2012-003。CB1受體特異性激動劑HU-210和CB1受體特異性拮抗劑AM281(USA)；抗CB1抗體(ab23703，0.5 mg/L；Abcam)；鉀通道非特異性阻斷劑四乙銨(tetraethylammonium，TEA；Sigma)。人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)：NaCl 150 mmol/L、KCl 5 mmol/L、MgCl21 mmol/L、CaCl21.2 mmol/L和HEPES 10 mmol/L，以上藥品溶于三蒸水后，用1 mol/L的NaOH或HCl調節(jié)pH至7.35～7.45。局部注射HU210或AM281均按照2 (dimethyl sulfoxide, DMSO) ∶1(Tween-80)∶37(0.9%saline)進行稀釋；TEA用0.9%的生理鹽水進行稀釋；灌流HU210或AM281溶于DMSO中配成母液，用ACSF稀釋成HU210(1 mmol/L)和AM281(10 mmol/L)最終灌流液；TEA用ACSF稀釋成TEA(10 mmol/L)最終灌流液。

2 方法

2.1慢性神經(jīng)病理性疼痛模型的建立 參照文獻報道的方法[9]，建立慢性神經(jīng)病理性疼痛模型：用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射C57BL/6J小鼠進行麻醉后，暴露左側坐骨神經(jīng)主干，用鼠尾膠原纖維(約同5#羊腸線直徑)從坐骨神經(jīng)中樞端到外周端依次輕度結扎打3個結，結扎環(huán)間0.1 mm，結扎松緊程度以左后肢出現(xiàn)輕微收縮為宜，對坐骨神經(jīng)形成區(qū)段性損傷。假手術：只暴露出坐骨神經(jīng)不結扎，其余步驟和建模完全一致。

2.2機械痛閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)的測定 術后3、5、7、9、11、13、15、17、19和21 d以及給藥前后進行測試，將小鼠放入底為鐵絲網(wǎng)的不透明有機玻璃箱(45 cm×20 cm×25 cm)內，讓小鼠在此環(huán)境適應 30 min ，待小鼠的梳理和探究活動基本消失后，用von Frey垂直刺激小鼠左后肢足底中部，持續(xù)加力，記錄能引起左后肢產生縮足反應的力，重復2～3次。

2.3熱縮腿反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)的測定 術后3、5、7、9、11、13、15、17、19和21 d以及給藥前后進行測試，將小鼠置于底為3 mm厚玻璃板的不透明有機玻璃箱 (45 cm×20 cm×25 cm) 中，使其適應30 min，待小鼠的梳理和探究活動基本消失后，熱刺激痛覺測試儀照射小鼠左后肢足底中部(落在足底的光斑直徑約為3 mm)，記錄從照射開始至小鼠出現(xiàn)抬腿回避時間即為TWL，照射時間不超過 30 s，以防小鼠足底灼傷。每只小鼠測量3 次，對側間隔 5 min，去掉最大和最小值，計算3 次 TWL 的平均值。

2.4Western blot測定小鼠坐骨神經(jīng)中CB1受體(CB1 receptor，CB1R)蛋白的表達 小鼠完成痛閾測定后處死，取損傷區(qū)坐骨神經(jīng)，提取總蛋白溶液，進行SDS-PAGE將蛋白半干轉至PVDF膜上(電壓13 V，1.5 h)，5%牛奶封閉1 h后加入抗CB1 R抗體(1∶500)，4 ℃過夜，洗膜后再用HRP標記的山羊抗兔IgG雜交， 室溫2 h。最后加入ECL試劑反應1～2 min顯像，用掃描儀行蛋白條帶掃描并進行蛋白條帶半定量分析。以CB1R和β-actin的比值作為表達強度。

2.5單纖維放電頻率變化的檢測 手術后7～16 d，烏拉坦腹腔注射麻醉小鼠，再次將損傷區(qū)域暴露，去除結扎線、游離損傷區(qū)段的坐骨神經(jīng)，用34～35 ℃正常灌流液浸浴損傷區(qū)域。在距離損傷區(qū)域約8 mm的中樞端處另行切口，暴露出一段正常未受損傷的坐骨神經(jīng)，再用34～35 ℃溫熱石蠟油浸浴正常區(qū)段的神經(jīng)，在顯微鏡下分離出中樞端神經(jīng)細束，切斷它與外周感覺輸入的聯(lián)系，使其僅與損傷區(qū)域相連。將分離出的神經(jīng)細束放于鉑金絲引導電極上，用Chart 5.5軟件觀察并記錄神經(jīng)細束的自發(fā)放電情況[15]，計算神經(jīng)傳導速度以對神經(jīng)纖維進行分類。速度大于2 m/s為A類神經(jīng)元，小于2 m/s為C類神經(jīng)元[15]。若出現(xiàn)了單個A纖維放電則進行記錄保存。神經(jīng)電活動信號經(jīng)Power Lab系統(tǒng)放大、采集之后輸入計算機系統(tǒng)，采樣頻率是10 kHz。順序記錄相鄰動作電位峰峰間期時間間隔，獲得神經(jīng)自發(fā)放電峰峰間期(inter-spike interval)序列，所得數(shù)據(jù)用Origin軟件分析并作相應的時間序列圖等。實驗中利用HU210、AM281和TEA替換正常灌流液灌流損傷區(qū)，分別記錄放電的頻率變化。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)或均數(shù)±標準誤(means±SEM)表示。組間差異檢驗用單因素方差分析(one-way ANOVA)或重復測量方差分析(repeated measure ANOVA)，組間多重比較行LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 坐骨神經(jīng)損傷區(qū)CB1受體伴隨疼痛閾值的降低而升高

與假手術(sham)組相比，CCI組小鼠痛閾顯著降低，術后14 d MWT和TWL均降至最低(P<0.01)，見圖1A、B。Western blot結果表明，損傷區(qū)CB1受體的表達水平于術后4 d顯著升高(P<0.01)，并于7、11和14 d保持較高水平，與手術前(0 d)相比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1C。

Figure 1.The changes of pain threshold and CB1 receptor (CB1R) expression in the injured area of the mice with chronic constriction injury (CCI). A: the mechanical withdrawal threshold (MWT) after von Frey test; B: the thermal withdrawal latency (TWL) after plantar test (Hargreaves method); C: the protein levels of CB1R detected by Western blot. Mean±SD.n=8 in A and B;n=4 in C.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vs0 d.

圖1CCI小鼠疼痛閾值和損傷區(qū)CB1受體蛋白表達水平的變化

2 坐骨神經(jīng)損傷區(qū)定位注射TEA顯著地抑制CB1受體的鎮(zhèn)痛作用

在術后11～14 d之間分別給損傷區(qū)定位注射HU210(5 μg/kg)后，MWT在30和60 min，TWL在30、60 和130 min均顯著升高，見圖2A～D；與HU210組相比，定位注射AM281(1 mg/kg)能夠抑制HU210的鎮(zhèn)痛作用，見圖2A、B；與HU210組相比，損傷區(qū)預先注射TEA(10 ng)亦能夠顯著抑制HU210的鎮(zhèn)痛作用，見圖2C、D。

Figure 2.The analgesic effect CB1 receptor agonist HU210 was inhibited by CB1 receptor antagonist AM281 (A, B) or potassium channel non-specific blocker TEA (C, D). A, C: the mechanical withdrawal threshold (MWT) after von Frey test; B, D: the thermal withdrawal latency (TWL) after plantar test (Hargreaves method). Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.

圖2外周損傷區(qū)CB1受體激活具有鎮(zhèn)痛作用，AM281或TEA能阻斷這種作用

3 HU210能夠顯著降低起步點自發(fā)放電的頻率，AM281抑制其作用

記錄到自發(fā)放電的A類纖維后選取100 s穩(wěn)定狀態(tài)，在灌流槽中先后灌入vehicle，記錄HU210對自發(fā)放電頻數(shù)變化的影響，觀察到HU210(100 nmol/L)能顯著降低每秒自發(fā)放電的個數(shù)(P<0.01)，見圖3A。在灌流槽中先灌入AM281(9 nmol/L) 之后灌入HU210 能顯著抑制HU210使放電頻率降低的作用，見圖3B。

Figure 3.Perfusion of HU210 in the injured area reduced the spontaneous ectopic discharge frequency of the injured nerve fibers (A), but AM281 (perfused about 20 min before HU210 administration) blocked this effect (B). Mean±SD.n=8 in A;n=6 in B.**P<0.01vsvehicle group.

圖3損傷區(qū)CB1受體激活抑制起步點自發(fā)放電活動，AM281能阻斷這種作用

4 TEA抑制HU210使起步點自發(fā)放電頻率降低的作用

同上述實驗方法，在損傷區(qū)灌流槽中分別灌入vehicle，觀察起步點放電頻率不變；之后灌入TEA阻斷鉀通道，觀察到與溶劑組相比放電頻率增加(P<0.01)；之后灌入TEA+HU210，與TEA組相比無顯著性差異，放電頻率沒有降低，但與vehicle組相比放電頻率顯著降低(P<0.01)，見圖4。這表明當鉀通道被阻斷之后，HU210激活CB1受體而抑制起步點自發(fā)放電的作用被抑制。

Figure 4.Perfusion of TEA increased the spontaneous discharge frequency in the injured area, and suppressed the inhibitory effect of HU210 on the spontaneous discharge frequency. A: statistical analysis of the firing frequency; B: the spike patterns of ectopic neuronal discharge; C: the representative spontaneous discharge state in a single nerve fiber. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsvehicle group.

圖4TEA抑制CB1受體激活引起的起步點自發(fā)放電頻率降低的作用

討 論

阿片類被廣泛應用于慢性疼痛癥的臨床治療，但長期使用會伴隨副作用，嚴重影響患者的生活質量，導致使用量減少，甚至拒絕使用；近年來，大麻素已成為阿片類藥物治療慢性疼痛的替代品[16]，其鎮(zhèn)痛機制也成為研究的熱點。本研究發(fā)現(xiàn)手術后第4天的疼痛閾值與假手術組相比出現(xiàn)了差異，且隨著疼痛閾值的降低損傷區(qū)的CB1受體至第21天均顯示出表達增加；損傷區(qū)定位注射CB1受體激動劑HU210具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，CB1受體的特異性拮抗劑AM281能夠阻斷其作用，同時預先注射TEA也能阻斷HU210的鎮(zhèn)痛作用；單纖維自發(fā)放電的記錄中發(fā)現(xiàn)HU210能夠使放電的頻率降低，而AM281能夠抑制這種作用，同時TEA也阻斷了此作用。上述結果提示鉀通道介導了HU210的鎮(zhèn)痛作用，且其效應部位在外周損傷區(qū)。

CB1受體是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體[17]，廣泛表達于外周神經(jīng)系統(tǒng)。在CCI大鼠模型中，同側脊髓后角淺層CB1受體表達上調，激活CB1受體能夠抑制熱痛敏和機械觸誘發(fā)痛[18]。外周初級感覺神經(jīng)元軸突上CB1受體激活，能夠對軀體、內臟疼痛以及炎癥性和神經(jīng)性疼痛產生鎮(zhèn)痛作用[8]。本研究觀察到小鼠CCI手術后，損傷區(qū)CB1受體的表達上調與脊髓后角淺層CB1受體表達上調結果相呼應，并且觀察到隨著疼痛閾值的降低，坐骨神經(jīng)損傷區(qū)CB1受體表達升高呈現(xiàn)動態(tài)變化的趨勢。在外周損傷區(qū)由于可使用技術有限，因此CB1受體的鎮(zhèn)痛機制還未完全清楚，但在本研究中利用分離小鼠坐骨神經(jīng)單纖維，可對起步點進行深入的研究，觀察到CB1受體激活能夠顯著抑制損傷區(qū)的自發(fā)放電頻率，CB1受體特異性的拮抗劑可阻止這種抑制作用。CB1受體激活后，促進G蛋白門控型內向鉀通道開放，產生外向鉀離子電流，使細胞超極化[19]，同時當神經(jīng)沖動再次達到突觸前神經(jīng)元后，鈣離子內流減少，鉀離子外流增加，突觸前神經(jīng)元去極化幅度降低，對突觸前神經(jīng)元釋放興奮性抑制性神經(jīng)遞質產生抑制作用[20]，對其它離子通道也具有調節(jié)作用[21]。起步點是形成疼痛的主要原因，提示CB1受體的鎮(zhèn)痛作用可能是參與抑制起步點的自發(fā)放電，與本文研究結果一致。

鉀離子通道依據(jù)其性質主要分為以下幾種。(1)電壓門控性鉀離子通道(voltage-gated K+channels，KV)[22]。KV1.1功能喪失會降低機械和熱痛敏的反應[22];KV1.2的活動抑制會降低機械和冷痛敏閾值[23]。(2)鈣激活鉀離子通道(Ca2+-activated K+channels，KCa；一種特殊離子通道，受胞內游離鈣離子調控)。鈣離子進入胞內引起級聯(lián)反應，增加胞內鈣離子濃度，而鉀離子外流，細胞膜電位復極化，影響放電產生、維持及其頻率變化。根據(jù)電導的大小可以分為小電導鉀離子通道(small conductance，SK)、中電導鉀離子通道(intermediate conductance，IK)和大電導鉀離子通道(big conductance，BK)。BK主要參與快速后超極化電流的形成，抑制了神經(jīng)元沖動的發(fā)放[24]，并且在痛感受器上TRPV1與BK共存[25]。SK通道調節(jié)中等后超極化電流和慢速后超極化電流，降低神經(jīng)元興奮性,限制神經(jīng)元的放電頻率，產生放電頻率適應[26]，在疼痛的緩解中發(fā)揮重要的作用。(3)初級感覺神經(jīng)元表達的雙孔域鉀離子通道(two-pore-domain K+channels，K2P)多達15種亞型，并且與緩解疼痛有關[27]，其中敲除TWIK1(two-pore weak inwardly-rectifying K+channel 1)能夠顯著增加機械和熱痛的閾值[28]。(4)G蛋白偶聯(lián)的內向性整流型鉀離子通道2(G protein-coupled inwardly-rectifying K+channel 2，GIRK2)表達在感覺神經(jīng)元上參與阿片類的鎮(zhèn)痛調節(jié)；ATP 敏感的鉀離子通道(ATP-sensitive K+channels，KATP)對炎癥反應引起的疼痛具有顯著的鎮(zhèn)痛作用[29]。多種亞型的鉀離子通道均參與外周疼痛的形成或鎮(zhèn)痛。坐骨神經(jīng)損傷誘發(fā)起步點放電異常，CB1受體激活顯著抑制放電活動水平，阻斷鉀離子通道能夠阻斷這種抑制作用，提示鉀離子通道介導了CB1受體激活在外周的鎮(zhèn)痛作用，但具體是那種類型還需要進一步探究。

本研究在小鼠慢性壓迫損傷模型基礎上，外周損傷區(qū)定位給藥，并用在體單纖維技術觀察CB1受體激活對A類神經(jīng)元自發(fā)放電的影響，探討CB1受體在外周的鎮(zhèn)痛作用，可能是通過鉀離子通道起作用，為進一步深入研究CB1受體的外周鎮(zhèn)痛作用提供依據(jù)，為新型大麻類鎮(zhèn)痛劑的研發(fā)提供參考。