于 慧， 楊曉敏， 屈雙麗， 秦 磊， 馮 月， 王占黎， 孫 剛△

(包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 1高血壓研究所, 2檢驗科， 內(nèi)蒙古 包頭 014030； 3天津市寧河區(qū)醫(yī)院心內(nèi)科, 天津 301504； 4包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014040)

心血管疾病嚴(yán)重危害人類健康。心肌肥大是許多心血管疾病終末期共同的病理生理表現(xiàn)，也是導(dǎo)致慢性心力衰竭的主要原因之一[1]。研究顯示，心肌細(xì)胞凋亡在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵作用，可能是引起心力衰竭的主要原因之一[2]；體內(nèi)實驗表明，抑制心肌細(xì)胞凋亡可以改善心臟收縮功能[3]。與正常心肌細(xì)胞相比，肥大心肌細(xì)胞凋亡率顯著增高，且對凋亡刺激因子的敏感性增加。心臟肥大細(xì)胞通過脫顆粒作用，釋放多種炎癥介質(zhì)，直接參與心肌凋亡的過程[4]。以往研究顯示，p38 MAPK在肥大心肌細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用[5-7]。Budak等[5]證實，抑制p38 MAPK能顯著上調(diào)Bcl-2蛋白的表達，進而抑制肥大心肌細(xì)胞凋亡。

微小RNA(microRNAs, miRNAs, miR)是一類長度約19～24個核苷酸分子組成的內(nèi)源性非編碼小分子RNA, 通過特異性結(jié)合靶基因mRNA的3′-端非翻譯區(qū)，抑制靶基因mRNA 的翻譯或促進其降解，從而發(fā)揮基因調(diào)控作用[8]。miR-139-3p是miR-139家族的主要成員之一，該家族在腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)控中起關(guān)鍵作用[9-10]。研究證實，miR-139-3p在多種腫瘤中差異表達，并參與了細(xì)胞凋亡的病理生理過程[11]。本課題組首次檢測到，在兩腎一夾高血壓大鼠心肌組織中miR-139-3p表達上調(diào)[12]。但是，miR-139-3p在肥大心肌細(xì)胞中的表達情況及其是否與心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)，目前尚不完全清楚。本研究通過建立低氧誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞凋亡模型，觀察miR-139-3p的表達情況，并探討其與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及主要儀器試劑

高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、II型膠原酶和5-溴-2′-脫氧尿苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)購自Gibco；缺氧盒購自日本三菱公司;MirVana miRNA提取試劑盒、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan Universal PCR Master Mix II擴增試劑盒、miR-139-3p引物 (002546)和U6 snRNA引物(001973)購自Applied Biosystems;Wistar乳大鼠(出生1～3 d)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2012-0001]；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BD;兔抗大鼠cleaved caspase-3 Ⅰ抗購自Cell Signaling Technology;兔抗大鼠GAPDH Ⅰ抗購于杭州賢至生物科技有限公司;山羊抗兔Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;miR-139-3p抑制劑(micrOFFTMrno-miR-139-3p inhibitor)和miR-139-3p抑制劑陰性對照(micrOFFTMinhibitor negative control)由廣州銳博生物科技有限公司合成。XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自BIO-RAD;ABI7500實時熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems。

2 方法

2.1細(xì)胞凋亡模型制備及實驗分組 參照Drawnel等[13]的方法，取1～3 日齡Wistar乳大鼠，無菌操作取出心臟以無血清DMEM高糖培養(yǎng)液洗3次，并剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊。使用0.6 g/L II型膠原酶5 mL消化10 min，37 ℃水浴中共消化7次，棄去首次消化液，以含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液終止消化。收集細(xì)胞懸液，1 000×g離心10 min, 吸出上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，經(jīng)200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁90 min。細(xì)胞上清液以約5×108/L細(xì)胞密度接種于6孔板中。加入0.1 mmol/L BrdU抑制成纖維細(xì)胞生長，24 h后換液。參照文獻報道[14]，通過低氧誘導(dǎo)方法建立新生大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡模型。心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞分為低氧(hypoxia)組和正常培養(yǎng)(normal control)組，每組設(shè)置3個平行孔。低氧組細(xì)胞置于37 ℃密閉的缺氧盒中(95% N2和 5% CO2)培養(yǎng)12 h，正常培養(yǎng)組細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

2.2心肌細(xì)胞凋亡的檢測 各組細(xì)胞造模后(每組3個平行孔)，使用流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率，使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BD Pharmingen)，按照試劑說明書進行操作。使用PBS洗滌2次，消化收集細(xì)胞后，加入100 μL binding buffer緩沖液重懸細(xì)胞，每個培養(yǎng)孔細(xì)胞均制成1×109/L的細(xì)胞懸液，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，室溫避光孵育15 min，再加入400 μL binding buffer緩沖液混勻后，使用流式細(xì)胞儀 (Canto II, BD) 檢測分析。此外各組細(xì)胞(每組3個平行孔)造模后，通過Western blot檢測凋亡模型中cleaved caspase-3的表達，使用M-PER哺乳動物細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒(Thermo)抽提每孔細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE后，PVDF膜濕轉(zhuǎn)(100 V，90 min)，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入兔抗大鼠cleaved caspase-3抗體(1∶1 000)和兔抗大鼠GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min；加入山羊抗兔Ⅰ抗(1∶4 000)室溫孵育2 h后，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光顯色，使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀檢測目的條帶，采用Bio-Rad Image LabTM軟件分析結(jié)果，以目的蛋白與GAPDH內(nèi)參照的比值表示蛋白相對表達量。

2.3RT-qPCR檢測miR-139-3p的表達 各組細(xì)胞造模后(每組3個平行孔)，使用PBS洗滌2次，采用MirVana miRNA提取試劑盒提取每個培養(yǎng)孔細(xì)胞總miRNAs，按產(chǎn)品說明書步驟操作。使用TU1900紫外分光光度計檢測miRNAs的純度和濃度，紫外分光光度計檢測抽提得到的miRNAs的A260/A280為1.9，使用相對定量比較Ct法對miR-139-3p的表達水平進行定量分析。采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNAs逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按產(chǎn)品說明書步驟操作，采用15 μL反應(yīng)體系：dNTP mix 0.15 μL；MultiscribeTMRT enzyme 1.0 μL；10×RT buffer 1.5 μL；RNase Inhibitor 0.19 μL；Nuclease free water 4.16 μL；RT primer 3 μL；miRNA樣品5 μL (10 ng)。反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min； 42 ℃ 30 min； 85 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的實時熒光定量擴增采用TaqMan Universal PCR Master Mix II 試劑盒，以U6 snRNA為內(nèi)參照(Applied Biosystems)。擴增效率一致性實驗采用5個倍比稀釋的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA(最高濃度的cDNA樣本為1 ng microRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)，以cDNA濃度稀釋度作為橫坐標(biāo)，ΔCt(miR-139-3p Ct值-內(nèi)參照U6 snRNA Ct值)為縱坐標(biāo)，繪制關(guān)系曲線，數(shù)據(jù)采用線性回歸分析，結(jié)果顯示，直線斜率的絕對值為0.009，接近于0，說明目的基因與內(nèi)參照基因的擴增效率一致性好，見圖1。實時熒光定量擴增采用20 μL反應(yīng)體系：2×TaqMan Universal Master Mix II 10 μL；miR-139-3p 或U6 snRNA探針引物20×TaqMan Assay 1.0 μL；cDNA模板與dH2O共9 μL(cDNA模板約為100 ng)。反應(yīng)條件按產(chǎn)品說明書步驟操作，每個反應(yīng)設(shè)3個復(fù)孔。相對定量反應(yīng)結(jié)果采用2-ΔΔCt方法分析[15]。

Figure 1.A plot of cDNA dilution ratio versus ΔCt in RT-qPCR.

圖1RT-qPCR中cDNA稀釋度與ΔCt的關(guān)系曲線

2.4miR-139-3p抑制劑轉(zhuǎn)染 心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞分為miR-139-3p抑制劑組(miR-139-3p inhibitor)和miR-139-3p抑制劑陰性對照組(negative control)，每組設(shè)置3個平行孔。miR-139-3p抑制劑組，應(yīng)用Lipofectamine 3000 (Opti-MEM配制)轉(zhuǎn)染miR-139-3p抑制劑，置于37 ℃密閉的缺氧盒中(95% N2和 5% CO2)繼續(xù)培養(yǎng)12 h； miR-139-3p抑制劑陰性對照組轉(zhuǎn)染miR-139-3p抑制劑陰性對照，置于37 ℃密閉的缺氧盒中(95% N2和 5% CO2)繼續(xù)培養(yǎng)12 h。各組細(xì)胞給藥造模后，采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot實驗檢測細(xì)胞凋亡情況(具體實驗操作方法同上)。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 原代心肌細(xì)胞的形態(tài)觀察

心肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，呈貼壁生長，可見少數(shù)細(xì)胞開始搏動，但搏動微弱，且節(jié)律不規(guī)則。48 h后觀察到心肌細(xì)胞呈梭形或多邊形，有偽足伸出，細(xì)胞之間可以相互接觸交織成網(wǎng)，多數(shù)心肌細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性節(jié)律性搏動，見圖2。

Figure 2.Micrograph of cultured rat neonatal cardiomyocytes after 48 h.

圖2培養(yǎng)48h后的原代心肌細(xì)胞形態(tài)

2 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡情況

低氧誘導(dǎo)12 h后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組比較，低氧組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖3。

3 Western blot檢測凋亡模型中cleaved caspase-3表達

低氧誘導(dǎo)12 h后，采用Western blot檢測凋亡模型中cleaved caspase-3的表達。結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組相比，低氧組細(xì)胞中凋亡蛋白cleaved caspase-3表達顯著升高(P<0.05)，見圖4。

4 低氧培養(yǎng)對miR-139-3p表達的影響

以RT-qPCR方法檢測miR-139-3p的表達情況。結(jié)果顯示，低氧培養(yǎng)12 h后，與正常培養(yǎng)組比較，低氧組心肌細(xì)胞中miR-139-3p的表達水平顯著上升(P<0.05)，見圖5。

Figure 3.The apoptosis rate of cardiomyocytes detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group.

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡率

Figure 4.The expression of cleaved caspase-3 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group.

圖4Westernblot檢測cleavedcaspase-3的表達情況

Figure 5.The relative expression of miR-139-3p detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group.

圖5RT-qPCR檢測miR-139-3p的表達情況

5 miR-139-3p抑制劑轉(zhuǎn)染后原代心肌細(xì)胞凋亡水平的變化

低氧誘導(dǎo)12 h后，流式細(xì)胞結(jié)果顯示，與miR-139-3p抑制劑陰性對照組相比， miR-139-3p抑制劑組心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.miR-139-3p inhibitor decreased the apoptosis rate of cardiomyocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖6miR-139-3p抑制劑轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞凋亡率的變化

Western blot結(jié)果顯示，miR-139-3p抑制劑組凋亡蛋白cleaved caspase-3表達也顯著降低(P<0.05)，見圖7。

Figure 7.miR-139-3p inhibitor decreased the expression of cleaved caspase-3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖7miR-139-3p抑制劑轉(zhuǎn)染后cleavedcaspase-3的表達情況

討 論

miR-139位于11號染色體PDE2A基因的第2外顯子上，在乳腺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞中異常表達[16-19]，進而參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[20-21]。課題組前期研究觀察到，miR-139-3p在兩腎一夾高血壓大鼠心肌組織中表達顯著上調(diào)，推測其可能參與了高血壓大鼠心肌肥厚的病理過程。信號通路分析軟件IPA(經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫)分析顯示，MAPK1是miR-139-3p的靶基因之一[12]，Budak等[5]進一步通過實驗證實了這一結(jié)論。已知MAPK1與心肌細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，因此，推測miR-139-3p可能與心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)。針對miR-139-3p表達調(diào)控機制，過去的研究大多圍繞著腫瘤等疾病。Huang等[22]的研究顯示，miR-139-3p能通過下調(diào)NOB1基因表達來顯著誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。但miR-139-3p與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系，尚不清楚。

為了證實這一推測，本實驗構(gòu)建了原代心肌細(xì)胞的凋亡模型。目前，低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡模型已被廣泛應(yīng)用。Tanaka 等[23]在體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞中觀察，在不更換細(xì)胞培養(yǎng)液的情況下低氧誘導(dǎo)12 h即可出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡，并且隨著低氧時間的延長逐漸加重。本實驗結(jié)果也證實，低氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，且促進cleaved caspase-3蛋白的表達。Cleaved caspase-3蛋白為caspase-3蛋白相對分子量約為17 kD的活性亞單位，一般認(rèn)為，當(dāng)細(xì)胞被凋亡信號激活時，無活性的caspase-3酶原被裂解為有活性的cleaved caspase-3，標(biāo)志著凋亡過程進入到不可逆轉(zhuǎn)階段[24]。上述結(jié)果表明，通過低氧誘導(dǎo)的方法成功地建立了原代心肌細(xì)胞凋亡模型。

本實驗采用RT-qPCR方法檢測miR-139-3p的表達水平，觀察到低氧組心肌細(xì)胞中miR-139-3p表達上調(diào)，抑制miR-139-3p表達能降低低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及cleaved caspase-3的表達，提示miR-139-3p可能與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。近期Diaz等[25]的研究顯示，在Wistar 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，miR-139-3p的表達水平顯著增高，尿皮質(zhì)素多肽(Urocortin)能通過下調(diào)miR-139-3p的表達水平發(fā)揮其對缺血再灌注心肌的保護作用，推測miR-139-3p的異常表達可能通過下調(diào)FoxO1等因子的表達參與了心肌缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡過程。本研究中，miR-139-3p在低氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型中表達水平顯著升高，miR-139-3p的表達被抑制后，心肌細(xì)胞的凋亡率也明顯下降，這一結(jié)果也在一定程度上證實了Diaz等[25]的研究推測。本研究著重探討了miR-139-3p與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系及可能機制，所獲結(jié)果有助于闡明心肌細(xì)胞凋亡的分子機制。但低氧誘導(dǎo)是否會引起心肌細(xì)胞的細(xì)胞周期變化和凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax和FoxO1的表達，以及miR-139-3p如何通過調(diào)控靶基因影響心肌細(xì)胞凋亡等，這些問題還有待今后進一步深入研究。