周 湧， 李心群， 李金亭， 許 文△

(1東莞市第五人民醫(yī)院檢驗科， 廣東 東莞 523899； 溫州醫(yī)科大學(xué) 2附屬第一醫(yī)院， 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

包括多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)在內(nèi)的多種自身免疫病與自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的過度活化有關(guān)[1]。將這些自身反應(yīng)T細(xì)胞當(dāng)作病原體，在體外活化并經(jīng)射線照射后可作為疫苗，即T細(xì)胞疫苗(T-cell vaccines，TCV)，可用于預(yù)防/治療這些自身免疫病[2]。我們先前的研究表明，射線照射可上調(diào)活化T細(xì)胞表面鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CALR)表達(dá)[3]。因此我們推測TCV治療自身免疫病的機(jī)制與射線上調(diào)活化T細(xì)胞表面的CALR表達(dá)有關(guān)。

實(shí)驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)在臨床表現(xiàn)及免疫病理方面與MS相似，是研究MS發(fā)病機(jī)制的經(jīng)典動物模型。本研究采用小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG35-55)誘導(dǎo)EAE動物模型，以射線照射的MOG35-55特異性T細(xì)胞為疫苗，探討細(xì)胞膜異位表達(dá)CALR對TCV接種EAE小鼠免疫效果的影響，以期為MS等自身免疫性疾病的生物治療提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗數(shù)據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗動物

雌性6～8周齡的C57BL/6購自上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司(合格證號：X1104063)，并飼養(yǎng)于本校實(shí)驗動物中心。所有實(shí)驗均遵守溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物福利和倫理原則，并隨時接受倫理委員會的監(jiān)督和檢查。

2 主要試劑

小鼠MOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)肽段由上海紫域聯(lián)生物科技有限公司合成，純度(HPLC)>95%；結(jié)核桿菌H37Ra購自Difco；完全福氏佐劑(complete Freund′s adjuvant，CFA)和百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)購自Sigma；胎牛血清和RPMI- 1640培養(yǎng)基購自HyClone；小鼠干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)、IL-10和IL-17A ELISA試劑盒購自R&D；兔抗鼠CALR多抗購自Abcam；FITC標(biāo)記羊抗兔IgG購自北京百奧生物；T細(xì)胞分離磁珠購自美天旎公司；FITC-兔抗鼠CD4及PE-兔抗鼠Foxp3和PE-兔抗鼠CD25購自eBiosciences；RPMI-1640完全培養(yǎng)基:以RPMI-1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ),加入10%的滅活的胎牛血清、1×105U/L青霉素及0.1 mg/L 鏈霉素。

3 主要方法

3.1抗原特異性T細(xì)胞制備 參照本實(shí)驗室方法[4]，將MOG35-55肽尾根部皮下注射以免疫C57BL/6 小鼠，制備抗原特異T細(xì)胞系(MOG-T)。體外培養(yǎng)的T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激48～72 h后細(xì)胞為活化態(tài)T細(xì)胞。使用前以磁珠分選純化CD4+T細(xì)胞，以CD4和CD25雙染檢測細(xì)胞類型及活化狀態(tài)?；罨蟮腡細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d 后作為靜息態(tài)T細(xì)胞。

3.2CALR表達(dá)分析 活化T細(xì)胞以γ射線(20 Gy)照射后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。分別于0、1、4和12 h取出部分細(xì)胞置于1.5 mL EP管中(每管1×106細(xì)胞)，加入FITC標(biāo)記的兔抗鼠CALR，4 ℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀(FACSAria，BD Biosciences)檢測，CellQuest 軟件分析。

3.3特異抗體封閉CALR表達(dá) 活化T細(xì)胞以γ射線照射后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入兔抗鼠CALR抗體，37 ℃孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測確認(rèn)封閉效果。

3.4EAE誘導(dǎo) 依文獻(xiàn)操作[5]，將MOG35-55用PBS稀釋成5 mg/L，并按1∶1等體積加入含結(jié)核桿菌H37Ra(終濃度5 g/L)的CFA，充分混合乳化。每只0.1 mL于C57BL/6小鼠尾根部兩側(cè)分4點(diǎn)皮下注射，第0和48 h腹腔注射0.5 mL PTX(每只500 ng)。采用5分制法對實(shí)驗小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評估。具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下： 無臨床癥狀為 0 分；尾部張力消失為 1 分；雙后肢無力為 2 分；后肢癱瘓為 3 分；雙后肢伴前肢癱瘓為 4 分；瀕臨死亡或死亡為 5 分。當(dāng)臨床癥狀介于2個評分之間時以±0.5記。

3.5小鼠免疫 將小鼠隨機(jī)分為正常對照(control)組、T細(xì)胞免疫(CALR+T)組、CALR封閉(CALR-T)組及PBS組，每組10只。正常對照組不做處理；CALR+T組和CALR-T組分別采用5×105～1×106CALR+T和CALR-T(100 μL)于EAE誘導(dǎo)前14 d尾靜脈免疫，EAE誘導(dǎo)后7 d，以相同劑量T細(xì)胞再次尾靜脈免疫 1 次；PBS組僅給予100 μL PBS。

3.6血清中細(xì)胞因子檢測 免疫后第15天尾根部取血，ELISA檢測血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17含量, 依試劑盒說明書操作。

3.7流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells， Treg)的比例 磁珠分離CD25+細(xì)胞，首先與FITC 標(biāo)記的anti-mouse CD4 抗體孵育30 min，洗滌后破膜，與PE 標(biāo)記的anti-mouse Foxp3 抗體孵育30 min(按試劑盒說明書操作), 洗滌后加流式緩沖液重懸細(xì)胞, 上流式細(xì)胞儀檢測。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)都表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)。 采用統(tǒng)計軟件為SPSS 19.0。單因素方差分析(one-way AVONA)作總體差異顯著性分析, 各組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 射線照射誘導(dǎo)活化CD4+ T細(xì)胞CALR膜轉(zhuǎn)位

我們首先通過[3H]-TdR摻入法及流式細(xì)胞術(shù)對用于免疫的T細(xì)胞系的抗原特異性及活化狀態(tài)進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明所用T細(xì)胞具有MOG特異性，見圖1A，且為活化態(tài)T細(xì)胞，見圖1B。另經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，經(jīng)20 Gy γ射線照射后，T細(xì)胞表面表達(dá)的CALR明顯升高，并具有時間依賴性，見圖1C。 而靜息的T細(xì)胞表面CALR并未有明顯變化，見圖1D。

Figure 1.The expression of CALR on the surface of MOG-T cells. A: antigen-specificity of T cells; B: activation stage of T cells; C: activated T cell group; D: resting T cell group. T: T cells; F: feeder. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsT+MOG+F group.

圖1MOG-T細(xì)胞表面CALR的表達(dá)

2 封閉CALR表達(dá)，降低TCV對EAE小鼠的免疫效果

為觀察CALR表達(dá)對TCV治療效果的影響，于免疫前，我們將所用T細(xì)胞與特異性抗體4 ℃反應(yīng)30 min以封閉CALR。結(jié)果表明CALR+T免疫組的臨床評分與PBS免疫組比較顯著降低(P<0.01)，而CALR-T細(xì)胞的免疫臨床評分與PBS免疫組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2。這說明封閉CALR降低了TCV對EAE小鼠的治療效果。

3 封閉CALR影響EAE小鼠血清中細(xì)胞因子的分泌格局

CD4+的Th1和Th17細(xì)胞過度活化是導(dǎo)致多發(fā)性硬化癥的關(guān)鍵因素。CALR+T細(xì)胞接種可抑制EAE小鼠Th1和Th17細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17A的產(chǎn)生及上調(diào)Th2和Treg細(xì)胞因子IL-4和IL-10。封閉TCV表面CALR后，IFN-γ和IL-17A的水平明顯上升，而IL-4和IL-10的水平明顯下降(P<0.01)，見圖3。這一結(jié)果表明CALR細(xì)胞膜異位表達(dá)在TCV誘導(dǎo)的Th1/Th2和Th17/Treg轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用。

Figure 2.Blockade of CALR decreased the protective effect of TCV in the EAE mice. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsPBS group.

圖2小鼠臨床癥狀評分

4 封閉CALR下調(diào)小鼠體內(nèi)Treg的數(shù)量

由于Treg在TCV誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，我們進(jìn)一步檢測了封閉CALR對TCV誘導(dǎo)Treg能力的影響。在疾病高峰期(免疫后第15天)取脾細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明封閉CALR顯著下調(diào)EAE小鼠外周淋巴組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，與CALR+T細(xì)胞接種組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

Figure 3.Blockade of CALR affected the cytokine patterns in the serum. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsPBS group.

圖3封閉CALR對血清細(xì)胞因子表達(dá)的影響

Figure 4.The changes of the number of Treg analyzed by flow cytometry. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vscontrol group.

圖4流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾Treg的數(shù)量

討 論

自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞是MS等多種疾病的主要致病因素。借鑒傳統(tǒng)疫苗的制備方法，將自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞當(dāng)作致病物質(zhì)，體外滅活后用作疫苗(TCV)，已成功用于此類疾病的治療，其機(jī)制主是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對自身反應(yīng)T細(xì)胞獨(dú)特型表位(如TCR CDR3表位)的抗獨(dú)特型及針對活化型表位(如CD25、HSP90等)的抗活化型CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，從而抑制致病性Th1、Th17反應(yīng)，達(dá)到預(yù)防/治療自身免疫病的目的[6]。然而為什么照射后的T細(xì)胞具有此種效應(yīng)仍不清楚。本研究表明射線照射可誘導(dǎo)活化T細(xì)胞表面異位表達(dá)CALR，從而賦予TCV誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生及抑制炎癥反應(yīng)的能力。

CALR是一種主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+結(jié)合蛋白，具有作為分子伴侶和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度等多種生物學(xué)功能。有研究表明，射線照射及某些化療藥物可誘導(dǎo)CALR從胞質(zhì)異位轉(zhuǎn)位到胞膜。膜型CALR可作為“eat me ”信號促進(jìn)樹突狀細(xì)胞對靶細(xì)胞的吞噬及加工抗原加工提呈能力[7]。

由于未經(jīng)射線照射處理的活化自身反應(yīng)T細(xì)胞不能作為TCV使用，因此我們推測射線照射可能誘導(dǎo)了CALR細(xì)胞膜的異位表達(dá)從而賦予其誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。為證實(shí)該假設(shè)，我們首先運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CALR在T細(xì)胞膜上的動態(tài)表達(dá)。結(jié)果顯示射線照射可誘導(dǎo)CALR在活化而非靜息T細(xì)胞膜上異位表達(dá)，并具有時間依賴性。之所以射線只誘導(dǎo)活化而非靜息的T細(xì)胞異位表達(dá)CALR，可能是機(jī)體存在一種與活化相關(guān)的死亡方式[8]。研究表明射線照射及某些化療藥物可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞免疫原性凋亡，免疫原性凋亡的腫瘤細(xì)胞以細(xì)胞表面異位表達(dá)CALR、Erp57及釋放HGMB1等損傷相關(guān)模式分子為特征[9]。我們的研究表明射線照射的活化T細(xì)胞具有免疫原性凋亡的特征。為證明在TCV誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫與CALR上調(diào)表達(dá)有關(guān)，我們以EAE小鼠為模型，觀察封閉CALR對TCV誘導(dǎo)保護(hù)性免疫效果的影響。與預(yù)期結(jié)果相一致，封閉CALR顯著下調(diào)TCV對EAE小鼠的治療作用。由于細(xì)胞在免疫原性凋亡過程中會表達(dá)多種損傷相關(guān)模式分子，因此并不排除這些分子與CALR共同發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。

Th1和Th17及其細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17等細(xì)胞因子的異常變化與多發(fā)性硬化發(fā)病密切相關(guān)。CD4+CD25+Foxp3+Treg可抑制Th1和Th17異?；罨谧陨砻庖卟?、腫瘤和器官移植等免疫病理發(fā)生中發(fā)揮重要作用[10]。本實(shí)驗通過干預(yù)CALR表達(dá)顯示CALR 與TCV誘導(dǎo)Treg的能力相關(guān)，下調(diào)CALR表達(dá)則EAE 小鼠外周免疫器官(脾臟)中Treg 細(xì)胞數(shù)量減少，炎性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17A水平明顯升高，而抗炎細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4下降，進(jìn)一步證實(shí)了CALR在TCV誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性保護(hù)免疫中的作用。

綜上所述，射線照射通過誘導(dǎo)活化T細(xì)胞表面異位表達(dá)CALR，從而賦予TCV誘導(dǎo)Treg、抑制免疫反應(yīng)而緩解EAE 小鼠臨床癥狀的能力。