饒盼盼 王晞 程玥 姜嬋 黃從新

2006年, Deisseroth等[1]首次定義光遺傳學(xué)(optogenetics)概念，即結(jié)合遺傳學(xué)與光學(xué)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究的新技術(shù)。利用特定波長(zhǎng)的光照激活表達(dá)在細(xì)胞膜上的光敏感離子通道蛋白，引起細(xì)胞內(nèi)外離子流動(dòng)，進(jìn)而達(dá)到精細(xì)調(diào)控靶細(xì)胞或靶器官生理功能的作用。該技術(shù)首先在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域迅猛發(fā)展，2010年被引入心臟研究領(lǐng)域，成為心電生理研究的一種新手段。其中興奮性的光敏感離子通道蛋白channelrhodopsin-2 (ChR2)是光遺傳學(xué)在心臟領(lǐng)域最為常用的光控元件，ChR2在接受470 nm左右的藍(lán)光照射時(shí)通道開放，H+、 Na+、 K+、Ca2+等陽(yáng)離子迅速流入細(xì)胞內(nèi)，引起心肌細(xì)胞去極化，產(chǎn)生相應(yīng)的電生理效應(yīng)[2]。目前心臟光遺傳學(xué)多以單個(gè)心肌細(xì)胞，計(jì)算機(jī)模型及小鼠離體心臟為對(duì)象開展研究，筆者擬建立光遺傳學(xué)大鼠心臟在體研究模型，為進(jìn)一步開展生理及病理狀態(tài)下心電生理及心臟功能研究提供相應(yīng)模式。研究選擇ChR2為心臟光遺傳學(xué)工具蛋白，以腺相關(guān)病毒為載體將ChR2轉(zhuǎn)染表達(dá)于SD大鼠心臟上，開展473 nm藍(lán)色可見光在體起搏的有效性及相關(guān)參數(shù)優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 健康SPF級(jí)SD幼鼠27只，由華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖飼養(yǎng)。腺相關(guān)病毒購(gòu)自和元生物技術(shù)股份有限公司。

1.2動(dòng)物分組及模型制備 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組：正常組、ChR2組、空載病毒組，每組9只。分別經(jīng)頸靜脈注射60 μl PBS、60 μl載有ChR2目的基因的腺相關(guān)病毒[AAV9-CAG-hChR2 (H134R)-mCherry]、60 μl空載病毒(AAV9-CAG-mCherry)。所有動(dòng)物在SPF級(jí)環(huán)境20～25℃ 恒溫飼養(yǎng)，靜脈注射8周后，大鼠按3%戊巴比妥鈉30 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。行常規(guī)氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，正壓通氣，潮氣量10～15 ml,呼吸頻率70 次/分。開胸，充分暴露右心室游離壁。

1.3心電生理評(píng)價(jià) 首先設(shè)置473 nm藍(lán)光的脈沖頻率為8 Hz，脈沖寬度為20 ms，功率密度為0.64 mw/mm2，以連續(xù)30個(gè)脈沖照射右心室游離壁，根據(jù)同步記錄的光輸出信號(hào)與體表心電圖判斷心臟節(jié)律是否被光脈沖奪獲。對(duì)能夠被光照奪獲的大鼠進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)研究。固定光照頻率8 Hz，脈沖寬度20 ms，改變光照功率密度(0.03～1.97 mw/mm2)，30個(gè)連續(xù)脈沖后間隔5 s重復(fù)照射右心室2次，觀察光照不同功率密度對(duì)心臟奪獲率的影響。奪獲率為成功奪獲心律的光脈沖個(gè)數(shù)與光脈沖發(fā)放總數(shù)之比。固定光照頻率8 Hz，改變脈沖波寬(2、5、10、20、50 ms)和功率密度(0.03～1.97 mw/mm2)，給予30個(gè)脈沖光照并重復(fù)2次，比較在不同脈沖波寬的條件下，光照完全奪獲起搏心臟所需的最小功率密度(光起搏功率密度閾值)。以頻率8 Hz ，脈沖寬度20 ms和相應(yīng)的2倍光起搏閾值藍(lán)光照射右心室，脈沖光照完全奪獲心臟節(jié)律，比較光照前、光照時(shí)、光照后心電圖RR間期、QRS波寬、QT間期是否存在差異。光輸出信號(hào)與體表心電圖均由Powerlab生理記錄儀(AD Instrument)同步記錄，以Labchart軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2．1藍(lán)光起搏心臟奪獲率研究 藍(lán)光照射ChR2組大鼠右心室可完全奪獲心臟節(jié)律，在一定范圍內(nèi)心臟奪獲率隨光照功率密度的增大而增加，1∶1奪獲可至100 %。ChR2組大鼠基礎(chǔ)心率為(334±48)次/分，給予30個(gè)8 Hz 的473 nm藍(lán)光脈沖照射右心室，光照脈沖信號(hào)與心電圖QRS波呈1∶1關(guān)系(圖1)。相同參數(shù)藍(lán)光光照正常組和空載病毒組大鼠心臟，心臟節(jié)律均未被光照奪獲。固定光照頻率和脈沖寬度，脈沖光照對(duì)心臟的起搏奪獲率隨藍(lán)光的功率密度增大而增加(圖2，在體心臟光起搏實(shí)驗(yàn)視頻見365醫(yī)學(xué)網(wǎng),鏈接http://www.365heart.com/videodata/show.asp?id=1750)。

2.2藍(lán)光起搏右心室閾值研究 473 nm 8 Hz 藍(lán)光起搏SD大鼠心臟右心室，光照脈沖寬度依次增加(2、 5、10、20、50 ms)，完全起搏心臟所需最小光照功率密度(mw/mm2)依次為0.46±0.33、 0.26±0.10、0.18±0.04、0.13±0.04、 0.16±0.07(圖3)。

2.3藍(lán)光起搏對(duì)心電圖的影響 采用功率密度為2倍起搏閾值，脈沖寬度20 ms的光照完全奪獲心臟節(jié)律，光照前與光照后心電圖RR間期、QRS波寬、QT間期無(wú)顯著差異(P>0.05)。光照前與光照時(shí)心電圖RR間期、QRS波寬存在顯著差異(P<0.05) ，但QT間期無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖4，表1)。

標(biāo)志光照開始

圖2不同功率密度8 Hz 20 ms藍(lán)光光照ChR2組大鼠右心室心臟奪獲率比較

3 討論

本研究利用載有ChR2目的基因的重組腺相關(guān)病毒9型，通過靜脈注射的方式，完成光敏感蛋白ChR2在SD大鼠心臟的表達(dá)并實(shí)施心臟光起搏的在體研究。證實(shí)473 nm藍(lán)光脈沖光照右心室，可成功起搏心臟，停止光照后心臟電生理特性迅速恢復(fù)，2倍起搏閾值光照對(duì)心電特性無(wú)明顯影響。并且初步摸索了473 nm藍(lán)光在體起搏SD大鼠心臟的相關(guān)光照參數(shù)及其之間的關(guān)系。心臟奪獲率在一定范圍內(nèi)與光照的功率密度成正相關(guān)關(guān)系，而光起搏功率密度閾值在一定范圍內(nèi)與光脈沖寬度成負(fù)相關(guān)關(guān)系。

光敏感蛋白ChR2是本研究的重要光學(xué)元件，由737個(gè)氨基酸組成，是一個(gè)7次跨膜的非選擇性陽(yáng)離子通道蛋白[3]。ChR2在光譜中的吸收峰值在470 nm左右，對(duì)活化光譜有毫秒級(jí)的響應(yīng)速度。在相應(yīng)波長(zhǎng)的光照下，ChR2迅速發(fā)生光學(xué)異構(gòu)反應(yīng)，ChR2中的全反式視黃醛轉(zhuǎn)變?yōu)?3-順視黃醛，繼而通道開放。細(xì)胞外H+、 Na+、 K+、Ca2+等陽(yáng)離子內(nèi)流，引起細(xì)胞去極化興奮。2003年，Nagel等[4]第一次將ChR2引入細(xì)胞研究，通過質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式成功將ChR2表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞、HEK293和BHK細(xì)胞上，并進(jìn)行了ChR2膜片鉗的相關(guān)研究。2010年，Arrenberg等[5]和Bruegmann等[6]先后將ChR2用于斑馬魚及轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟研究。2015年Vogt等[7]通過頸靜脈注射腺相關(guān)病毒AAV9-CAG-hChR2(H134R)-mCherry的方式，成功將ChR2表達(dá)在野生型小鼠心臟上，并驗(yàn)證藍(lán)光起搏離體心臟的有效性。2015年，Nussinovitch等[8]通過心臟局部多位點(diǎn)注射腺相關(guān)病毒AAV-CAG-ChR2-GFP，使ChR2在SD大鼠心臟多位點(diǎn)表達(dá)，并進(jìn)行心外膜上兩點(diǎn)同時(shí)起搏的相關(guān)研究。2016年，Bruegmann等[9]利用470 nm藍(lán)光光照表達(dá)ChR2的轉(zhuǎn)基因小鼠心臟心外膜成功除顫并進(jìn)行人類心臟光除顫的計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)，初步探索其可行性。近年來(lái)光遺傳學(xué)技術(shù)作為一種新的研究手段，逐步顯示出在起搏、除顫、再同步化等研究的優(yōu)勢(shì)，但是在體研究模型仍較缺乏，限制了病理狀態(tài)下該技術(shù)用于機(jī)制和治療研究的探索。因此，本研究嘗試通過靜脈注射的方式使ChR2在大鼠心臟系統(tǒng)性表達(dá)，并采用473 nm藍(lán)光光照驗(yàn)證大鼠在體模型的有效性，且均取得初步成功。

光遺傳學(xué)技術(shù)因其在遺傳學(xué)與光學(xué)結(jié)合的技術(shù)特點(diǎn)，使心臟光遺傳研究具有以下優(yōu)勢(shì)：①細(xì)胞選擇性。通過基因編輯技術(shù)，將光敏感蛋白基因序列與特異性啟動(dòng)子相融合，能夠使光敏感蛋白在心臟特殊類型或亞類細(xì)胞上表達(dá)[10-11]，為明確心臟中每種細(xì)胞類型在心電生理中的作用提供了新的手段；②非擴(kuò)布性。光遺傳學(xué)技術(shù)是通過光照驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)外離子流動(dòng)，達(dá)到控制細(xì)胞興奮性目的。通過控制光斑大小，能夠精確興奮細(xì)胞數(shù)量。與電刺激相比，具有高時(shí)空精準(zhǔn)性特點(diǎn)[12]； ③ 靈活性。光照無(wú)需特殊傳導(dǎo)介質(zhì)，在空氣、液體中即可傳播，無(wú)需與心臟接觸即可達(dá)到光控目的，結(jié)合心臟不同部位光照順序及路徑的程序性調(diào)控，使光照模式具有非接觸的靈活性特點(diǎn)[13]；④ 光的穿透性。近幾年，神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域有學(xué)者利用近紅外光較強(qiáng)的組織穿透性，利用上轉(zhuǎn)換納米材料將980 nm左右的近紅外光轉(zhuǎn)換成470 nm左右的可見光，進(jìn)行穿透組織的光遺傳學(xué)研究[14-16]，為心臟無(wú)導(dǎo)線起搏甚至體外起搏提供了一種新思路。當(dāng)然，光起搏向臨床的轉(zhuǎn)化，還需要突破很多難題[17]。但作為一種新技術(shù)，為心臟領(lǐng)域的科學(xué)研究提供了新的可能。

標(biāo)志光照開始。A-E：脈沖寬度依次為2、5、10、20、50 ms

圖4 藍(lán)光光照ChR2組大鼠右心室前后及光照時(shí)心電圖比較

表1 光照前后及光照時(shí)ChR2組大鼠心電圖參數(shù)比較

注：與光照前比較，*P<0.05