唐 磊，張 弛，秦 亞，孫浩杰，張 楠，張百惠，蔡亞南，魏戰(zhàn)勇

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002)

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，以出血性腸炎和心肌炎為主要發(fā)病特征，并伴有劇烈嘔吐、便血、食欲不振、精神沉郁等臨床癥狀。該病毒于1978年在澳大利亞患腸炎的犬中首次被分離出[1]，隨后在世界范圍內(nèi)陸續(xù)被報道。1983年，徐漢坤等[2]在我國首次正式報道了該病的流行情況。犬細(xì)小病毒病與犬瘟熱、犬冠狀病毒病并稱為犬類的三大傳染病，嚴(yán)重危害到我國養(yǎng)犬業(yè)與寵物行業(yè)的健康發(fā)展。

CPV為無囊膜、單鏈DNA病毒。病毒基因組由5 323個堿基組成，含有2個主要的開放性閱讀框(Open reading frame，ORF)，分別編碼2個非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2與3個結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3[3]。病毒衣殼由60個結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中VP2是病毒衣殼中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，占病毒衣殼的90%，有53～54個。在VP2蛋白的N端以及蛋白轉(zhuǎn)角區(qū)loop1和loop3均存在重要的抗原表位，因此，VP2基因的序列發(fā)生氨基酸替代，可能引起病毒抗原性的改變[4]。VP2基因組兩端存在2個發(fā)卡結(jié)構(gòu)(3′端Y型和5′端U型)，在病毒復(fù)制過程中起著重要的作用，但這2個發(fā)卡結(jié)構(gòu)也能夠阻礙病毒基因組的全序列測序及分析[5]。

在本研究中，將從經(jīng)CPV膠體金試紙鑒定為陽性的病犬糞便中成功分離出的1株CPV病毒，進(jìn)行理化性質(zhì)、血凝試驗、病毒全基因組測序鑒定以及基因組序列分析，以期了解河南省目前CPV流行趨勢，為該病的治療與預(yù)防提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試細(xì)胞與試劑 胎牛血清、MEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自Hyclone公司；蛋白酶K、瓊脂糖購自Promega公司；DL2000 DNA Marker、pMD18-T載體購自大連寶生物公司；DNA凝膠回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；DNA提取試劑盒、PrimeSTAR HS DNA Polymerase購自上海生工生物工程有限公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。F81細(xì)胞為河南省動物性食品安全重點實驗室保存。

1.1.2 病料的收集與處理 于鄭州市某動物醫(yī)院，收集經(jīng)CPV膠體金試紙鑒定為陽性的病犬血便病料1份。將收集的CPV感染犬的血便病料，按照1∶10的比例用PBS稀釋，加入等量的氯仿混勻，再加入雙抗，于4 ℃過夜。然后于8 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 病料DNA提取 取處理好的病料樣品提取DNA，具體步驟參照DNA提取試劑盒的操作說明，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測引物PCR鑒定 根據(jù)GenBank收錄的CPV-LZ2序列(登錄號：JQ268284)，針對病毒的NS1、VP2基因區(qū)域，運用Primer 5.0軟件設(shè)計2對檢測引物(表1)[6]，引物由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表1 CPV檢測引物序列

采用50 μL的PCR擴增體系：TaqMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板DNA 4 μL，最后用滅菌雙蒸水添加至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取8 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，并用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收與純化。將純化后的產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于Amp+瓊脂平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑選單個菌落進(jìn)行擴大培養(yǎng)，將菌液PCR鑒定為陽性的菌液送往武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

1.2.3 CPV病毒分離 取1.1.3中處理好的病料樣品，進(jìn)行10倍稀釋后同步接種于F81細(xì)胞[7]，另設(shè)有不接種的F81細(xì)胞作為陰性對照，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)并進(jìn)行記錄，待CPE達(dá)到80%時，收取病毒，并盲傳5代，取第5代病毒[8]，運用Reed-Muench法測定其組織半數(shù)感染量(Tissue culture infective dose，TCID50)[9]。收獲每代病毒，-80 ℃保存。

1.2.4 CPV血凝(HA)試驗 根據(jù)CPV可以凝集豬紅細(xì)胞這一特性，制備1%豬紅細(xì)胞懸液，取第5代病毒，按血凝試驗[10]的操作方法鑒定CPV病毒的血凝效價。

1.2.5 CPV理化性質(zhì)試驗 用20%乙醚處理CPV病毒后進(jìn)行脂溶劑敏感試驗；用pH值為3.0的酸處理病毒進(jìn)行耐酸性試驗；56 ℃加熱30 min，對病毒進(jìn)行耐熱性試驗[11]。每組試驗均設(shè)立陰性對照組，進(jìn)行相應(yīng)處理后，分別測定陰性對照組與試驗組的TCID50。

1.2.6 CPV全基因組測序 根據(jù)GenBank收錄的CPV-LZ2序列(登錄號：JQ268284)，運用Primer 5.0軟件設(shè)計9對引物序列(表2)。其中，Y1、Y2用于Y型發(fā)卡結(jié)構(gòu)擴增，U1、U2用于U型發(fā)卡結(jié)構(gòu)擴增，A1—A5用于編碼區(qū)序列擴增，引物均由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表2 CPV全基因組引物序列Tab.2 CPV whole genome primers

編碼區(qū)片段擴增采用50 μL的PCR擴增體系：TaqMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板DNA 4 μL，最后用滅菌雙蒸水添加至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物8 μL于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，并用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收與純化。兩端的發(fā)卡結(jié)構(gòu)片段擴增采用25 μL反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，上游引物1 μL，dNTP 2 μL，5×GC Buffer 5 μL，混勻后于98 ℃反應(yīng)5 min，迅速置于冰上5 min，然后加入PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，混勻后于72 ℃反應(yīng)3 min，加入下游引物1 μL，添加滅菌雙蒸水至25 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 45 s；98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物8 μL于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，并用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收與純化。

將純化后的產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于Amp+瓊脂平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑選單個菌落進(jìn)行擴大培養(yǎng)，將菌液PCR鑒定為陽性的菌液送往武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

1.2.7 CPV全基因組序列分析 將1.2.6中引物的擴增片段用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接，運用MegAlign軟件將拼接好的CPV全基因組序列與GenBank上收錄的17株國內(nèi)CPV參考毒株(表3)進(jìn)行核苷酸同源性比對分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表3 CPV參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的PCR鑒定結(jié)果

引物NS1和VP2 PCR擴增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，分別得到324 bp和388 bp的核酸電泳條帶(圖1)，與預(yù)期值大小相符。并將陽性菌液的測序結(jié)果與GenBank收錄的CPV-LZ2序列(登錄號：JQ268284)參考株序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明收集的血便病料內(nèi)存在CPV。

M：DL2000 DNA Marker； 1：引物NS1擴增片段； 2：引物VP2擴增目的片段； N：陰性對照 M:DL2000 DNA Marker; 1:Primer NS1 amplified fragment;2:Primer VP2 amplified target fragment; N:Negative control

2.2 CPV病毒的分離

接種10倍稀釋的血便病料樣品于F81細(xì)胞后，經(jīng)過48 h盲傳至第2代時，F(xiàn)81細(xì)胞開始出現(xiàn)脫落、拉網(wǎng)、聚集、變形等明顯的細(xì)胞病變，繼續(xù)盲傳至第5代，F(xiàn)81細(xì)胞均產(chǎn)生典型的CPE(圖2A)，而陰性對照組未接種病料樣品的F81細(xì)胞呈梭型，生長良好，形態(tài)正常，細(xì)胞連接緊密，未出現(xiàn)任何細(xì)胞病變(圖2B)。收獲每代病毒，-80 ℃保存，將其命名為CPV/HN1。

A：CPV感染F81細(xì)胞； B：正常F81細(xì)胞

2.3 CPV/HN1病毒的血凝效價檢測結(jié)果

待CPV/HN1病毒盲傳至第5代，取第5代病毒。根據(jù)犬細(xì)小病毒可以對豬紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集效應(yīng)，制備1%豬紅細(xì)胞懸液，按HA試驗操作方法進(jìn)行血凝效價測定，結(jié)果顯示其血凝效價為1∶256。

2.4 CPV/HN1病毒TCID50的測定結(jié)果

按TCID50試驗操作方法對盲傳至第5代的CPV/HN1病毒進(jìn)行TCID50測定，根據(jù)Reed-Muench法計算CPV/HN1第5代病毒的TCID50，其值為10-4.85/0.1 mL。

2.5 CPV/HN1病毒理化性質(zhì)試驗結(jié)果

經(jīng)乙醚和酸(pH值3.0)加熱處理后，CPV/HN1病毒的TCID50均無明顯變化，處理組與對應(yīng)的未處理對照組TCID50均無顯著差異，說明該病毒對酸、熱和有機溶劑均具有較強抵抗力，這與犬細(xì)小病毒相關(guān)理化性質(zhì)相符。

2.6 CPV/HN1病毒全基因組測序結(jié)果及序列分析

如圖3所示，CPV/HN1病毒編碼區(qū)PCR擴增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，A1的目的片段長度為1 156 bp、A2的目的片段長度為1 004 bp、A3的目的片段長度為1 052 bp、A4的目的片段長度為1 061 bp、A5的目的片段長度為1 016 bp，均與預(yù)期結(jié)果相符；如圖4所示，經(jīng)PCR擴增后，Y1的目的片段長度為66 bp、Y2的目的片段長度為712 bp、U1的目的片段長度為312 bp、U2的目的片段長度為101 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

M：DL2000 DNA Marker； N1—N5：陰性對照；A1—A5：編碼區(qū)域目的片段擴增

M：DL2000 DNA Marker； Y1—U2：發(fā)卡結(jié)構(gòu)目的片段擴增； N：陰性對照

如圖5所示，對CPV/HN1病毒的VP2氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其發(fā)生了Asn426Asp的氨基酸突變，但并沒有發(fā)生Val555Ile的氨基酸突變，同時還發(fā)生了Ser297Ala的突變，證明其屬于New CPV-2b亞型。拼接得到全基因組序列總長為5 052 bp，與模板序列進(jìn)行比對，其中U型發(fā)卡結(jié)構(gòu)全長為188 bp，Y型發(fā)卡結(jié)構(gòu)全長為120 bp，ORF1全長為2 007 bp并編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，ORF2全長為2 257 bp并編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2。

如圖6所示，通過與GenBank上登錄的國內(nèi)17株CPV核苷酸序列進(jìn)行比對，核苷酸同源性在96.4%～99.9%，其中CPV/HN1病毒與廣東分離株CPV-SC02/JX660690.1/2012同源性最低為96.4%，與北京分離株CPV-BJL1/MH106698.1/2018和CPV-BJL3/MH106700.1/2018同源性最高為99.9%。此外，CPV/HN1病毒同2018年以來北京的3株分離株具有較高的同源性，因此推測CPV/HN1病毒與國內(nèi)北京分離毒株具有相同的起源。

CPV全基因組進(jìn)化樹分析如圖7所示，CPV/HN1病毒與北京毒株CPV-BJL1/MH106698.1/2018、CPV-BJL2/MH106699.1/2018、CPV-BJL3/MH106700.1/2018處于同一分支且具有較近的親緣關(guān)系，與國內(nèi)蘭州、吉林、上海等分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?？傮w而言，CPV/HN1病毒分離株與近年來北京分離株親緣關(guān)系較近，同國內(nèi)其他分離株親緣關(guān)系疏遠(yuǎn)，推測CPV/HN1病毒分離株的流行同北京毒株相關(guān)。

圖5 CPV/HN1病毒VP2蛋白氨基酸序列分析Fig.5 Amino acid sequence analysis of VP2 protein of CPV/HN1

圖6 CPV/HN1病毒全基因組核苷酸同源性分析Fig.6 Nucleotide homology analysis of CPV/HN1 genome

圖7 CPV/HN1病毒進(jìn)化樹分析Fig.7 Analysis of CPV/HN1 phylogenetic tree

3 結(jié)論與討論

隨著人們生活水平的提高，以寵物行業(yè)為首的養(yǎng)犬行業(yè)高速發(fā)展。隨著養(yǎng)犬?dāng)?shù)量日益增加，CPV發(fā)病率不斷上升，嚴(yán)重制約了我國養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。因此，加強CPV感染機制及流行病學(xué)調(diào)查的研究，對該病的預(yù)防及治療具有重要的生產(chǎn)意義。

目前，CPV的預(yù)防主要以免疫接種為主，但即使進(jìn)行有效的疫苗接種，該病依然在世界范圍內(nèi)廣泛流行[13]。自1978年該病毒首次被分離以來，病毒先后進(jìn)行了多次基因變異，產(chǎn)生了3種主要的抗原變異型CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c，其中變異型CPV-2a和CPV-2b主要在一些亞洲國家流行，變異型CPV-2c主要分布于歐洲及美洲各國。近年來研究發(fā)現(xiàn)，新的變異型New CPV-2a、New CPV-2b和New CPV-2c在亞洲、美洲和歐洲等地開始出現(xiàn)[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，VP2基因的定向漂移引發(fā)了各種變異型的產(chǎn)生，CPV-2a的VP2蛋白相較于CPV-2，發(fā)生了Met87Leu、Ile101Thr、Ala300Gly、Asp305Tyr以及Val555Ile的氨基酸突變；而CPV-2b的VP2蛋白相較于CPV-2a多了Asn426Asp的氨基酸突變，但并沒有發(fā)生Val555Ile的氨基酸突變；CPV-2c的VP2蛋白相較于CPV-2b除發(fā)生了相同的氨基酸突變外，還在Asp426Glu和Ser297Ala發(fā)生了突變，這些突變導(dǎo)致了生物學(xué)性質(zhì)的改變[15]。通過與CPV-2a、CPV-2b比較發(fā)現(xiàn)，新變異株New CPV-2a、New CPV-2b發(fā)生了Ser297Ala的氨基酸突變，該位點的氨基酸突變可作為判斷New CPV-2a和New CPV-2b的標(biāo)志，另外，某些New CPV-2a和New CPV-2b還發(fā)生了Phe267Tyr、Tyr324Ile和Thr440Ala突變[15]。CPV雖然屬于DNA病毒，但是它的復(fù)制過程依然依賴于宿主細(xì)胞，并且由于它屬于單鏈DNA，在復(fù)制過程中的復(fù)制效率及糾錯能力不高，導(dǎo)致該病毒基因組的堿基突變率高于一般的DNA病毒，而與某些RNA病毒相當(dāng)，但該特點導(dǎo)致CPV對環(huán)境與宿主的適應(yīng)性及逃避宿主免疫應(yīng)答能力大大提高，從而提升了CPV的進(jìn)化效率以及在宿主動物中的傳播能力[16]。

CPV全基因組5′端和3′端存在有末端回文序列形成的末端發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在病毒的復(fù)制過程中起著起始和包裝信號等重要作用[17]。目前為止，由于其兩端發(fā)卡結(jié)構(gòu)的克隆與測序的困難性，導(dǎo)致基因組數(shù)據(jù)庫中僅僅存在幾株完整的CPV全基因組序列，這嚴(yán)重阻礙了CPV全基因組及其感染機制的研究工作[18]。結(jié)合文獻(xiàn)報道，本研究最終克隆并測序出末端2個發(fā)卡結(jié)構(gòu)，成功拼接出完整的CPV全基因組序列。

本研究從患病犬血便中成功分離出1株CPV毒株，通過對該CPV病毒分離株的PCR鑒定、血凝試驗、病毒分離試驗和病毒理化性質(zhì)試驗，以及全基因組測序，證明該毒株確實是CPV，并將其命名為CPV/HN1。對該毒株的全基因組克隆及測序顯示，該毒株為New CPV-2b亞型，通過與17株國內(nèi)CPV流行毒株全基因組序列核苷酸同源性分析，顯示同源性在96.4%～99.9%，相較于國內(nèi)其他毒株，與北京毒株，同源性較高，其中與CPV-BJL1/MH106698.1/2018和CPV-BJL3/MH106700.1/2018北京分離株同源性最高為99.9%。CPV/HN1病毒的成功分離，為河南省CPV的流行、遺傳進(jìn)化等研究提供理論數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為CPV疫苗的開發(fā)與應(yīng)用提供材料基礎(chǔ)，同時為CPV的感染機制及感染模型建立研究提供選擇的方向。