羅麗芳 李青 蔡立婧

[摘要] 目的 研究桃葉珊瑚苷（AU）對(duì)血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞（CFs）增殖的影響及作用機(jī)制。 方法 采用胰酶消化法及差速貼壁法培養(yǎng)大鼠CFs，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）干預(yù)組、低濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（1 μmol/L）]、中濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（10 μmol/L）]、高濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（100 μmol/L）]。用CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定細(xì)胞上清中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)活性氧（ROS）水平，Western blot法檢測(cè)p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)。 結(jié)果 與Ang Ⅱ干預(yù)組比較，中、高濃度AU干預(yù)組CFs增殖和p38MAPK磷酸化被明顯抑制（P < 0.05）。與Ang Ⅱ干預(yù)組比較，低、中、高濃度AU干預(yù)組ROS、Ⅰ、Ⅲ 型膠原的生成明顯減少（P < 0.05）。 結(jié)論 AU可通過(guò)ROS-MAPK通路途徑抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原生成。

[關(guān)鍵詞] 桃葉珊瑚苷；心肌成纖維細(xì)胞；增殖；活性氧；p38絲裂原活化蛋白激酶

[中圖分類號(hào)] R541.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）04（b）-0014-04

Anti myocardial fibrosis effects of aucubin based on ROS-MAPK signaling pathway

LUO Lifang LI Qing CAI Lijing

Department of Pharmacy， Jiangxi Provincial People′s Hospital， Jiangxi Province， Nanchang 330006， China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of aucubin （AU） on cardiac fibroblasts （CFs） proliferation induced by angiotension Ⅱ （Ang Ⅱ）. Methods Rat CFs were cultured by the methods of trypsin digestion and differential adhesion. They were divided into blank control group， Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） intervention group， low concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （1 μmol/L）]， medium concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （10 μmol/L）]， high concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （100 μmol/L）]. CCK8 method was used to test cell proliferation activity， collagen type Ⅰ， Ⅲ content in cell supernatant were determed by enzyme linked immunosorbent （ELISA）， fluorescence enzyme standard instrument was used to detect reactive oxygen species （ROS） level， Western blot method was used to detect p38MAPK and p-p38MAPK protein expression. Results Compared with Ang Ⅱ intervention group， CFs proliferation and p38MAPK phosphorylation were significantly inhibited in the medium and high concentration AU intervention groups （P < 0.05）. Compared with Ang Ⅱ intervention group， low， medium and high concentration of AU intervention group ROS， the production of collagen type Ⅰ， Ⅲ decreased significantly （P < 0.05）. Conclusion AU can restrain by ROS-MAPK pathway Ang Ⅱ induction of CFs proliferation and collagen formation.

[Key words] Aucubin； Cardiac fibroblasts； Proliferation； ROS； p38MAPK

目前，心血管疾病已嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康，由其引發(fā)的死亡率已位居總死因的首位[1-2]。眾多心血管疾病不斷進(jìn)展的共同結(jié)局是心肌纖維化，可使室性心律失常頻發(fā)及血流動(dòng)力學(xué)異常，最終導(dǎo)致死亡。抑制或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化成為治療多種心臟疾病的最關(guān)鍵的一步[3-4]。桃葉珊瑚苷（aucubin，AU）屬環(huán)烯醚萜苷類化合物，主要存在于忍冬科、車前科、杜仲科植物中，是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗病毒、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[5-7]。研究[8]表明，AU及苷元能清除DPPH自由基、超氧陰離子等自由基，對(duì)PCI2細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。最新研究[9]發(fā)現(xiàn)，桃葉珊瑚苷可能通過(guò)抑制活性氧（ROS）介導(dǎo)的MAPK通路的激活來(lái)延緩肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展?；谏鲜鲅芯?，本研究探討AU抗心肌纖維化的作用，并探討其作用機(jī)制與ROS-MAPK信號(hào)通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生（2 d齡）雄性SD大鼠，體重（8.5±1.2）g，由南昌大學(xué)動(dòng)物科學(xué)部提供，合格證號(hào)：SYXK（贛）2015-0001。飼養(yǎng)條件：新生大鼠和母鼠同放在金屬飼養(yǎng)籠中，室溫（24±1）℃，人工照明12 h/d（7：00～19：00），自由飲食及飲水，新生大鼠由母鼠喂養(yǎng)。

1.1.2 藥品與試劑 桃葉珊瑚苷標(biāo)準(zhǔn)品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：20161123），血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：A9525），DMEM高糖培養(yǎng)基（凱基生物有限公司，批號(hào)：20150318），CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（全式金，批號(hào)：#J20705），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)：20170413），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20170524），小鼠抗p38 MAPK（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：B1655）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：B1643），兔抗波形蛋白（Vimentin）抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：B1607），ROS檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：S0033），Ⅰ型膠原檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海拜力生物科技公司，批號(hào)：20170303）、Ⅲ型膠原檢測(cè)ELISA試劑盒（上海拜力生物科技公司，批號(hào)：20160224）。

1.1.3 主要儀器 迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一儀器廠）；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio Tek Synergy H1）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）的獲得與培養(yǎng) 將出生2 d的SD大鼠在75%乙醇中浸泡數(shù)秒，對(duì)其頸部以下進(jìn)行消毒，開(kāi)胸取出大鼠心臟，用磷酸鹽緩沖液（含雙抗）清洗3次，并剪碎。依次加入0.01% Ⅱ型膠原酶、0.06%胰蛋白酶消化5 min，收集上清液，重復(fù)消化2次，收集懸浮液，1000 r/min，5 min離心過(guò)濾后留取沉淀物，置于37℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱中。采用差速貼壁法分離培養(yǎng)出CFs，經(jīng)免疫組化染色（Vimentin陽(yáng)性）鑒定證實(shí)為CFs，待CFs細(xì)胞生長(zhǎng)融合時(shí)傳代，3～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）干預(yù)組、低濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（1 μmol/L）]、中濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（10 μmol/L）]、高濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（100 μmol/L）]。細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)，給予相應(yīng)措施。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將細(xì)胞均勻接種至96孔板內(nèi)，置于溫箱培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)基更換為1%血清的培養(yǎng)基饑餓12 h，各組采用相應(yīng)措施干預(yù)36 h后，將培養(yǎng)基換為含有10 μL CCK-8的無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL，置于37℃孵育2 h，使用ELISA檢測(cè)儀檢測(cè)A450值。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量 將培養(yǎng)細(xì)胞用胰酶消化后計(jì)數(shù)，以1000個(gè)/孔接種至24孔培養(yǎng)板孔內(nèi)。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，加入含1%血清的培養(yǎng)基饑餓12 h后加入不同處理因素的培養(yǎng)基，36 h后收集上清液。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。各組細(xì)胞的上清液分別加入包被了抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體的96孔板，溫育2 h后洗滌，加入酶標(biāo)抗體工作液和顯色液，終止反應(yīng)后使用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)490 nm）測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出各組Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量。

1.2.5 ROS的測(cè)定 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。將各組干預(yù)后的細(xì)胞用PBS洗滌2～3次，并加入1 mL DCFH-DA稀釋液（10 μmol/L），孵育20 min，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，在酶標(biāo)儀下觀察熒光（485 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm為發(fā)射波長(zhǎng)）。ROS水平（%）=干預(yù)組熒光值/空白對(duì)照組熒光值×100%，將空白對(duì)照組設(shè)為參考值100%，其余組ROS水平與之對(duì)比即得出相對(duì)ROS水平。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞加入組織裂解液，4℃，裂解30 min，10 000 r/min離心10 min，吸取上清，即可獲得總蛋白。按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，于濕轉(zhuǎn)槽內(nèi)將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)一抗（1∶1000）4℃孵育過(guò)夜后，二抗（1∶2000）溶液中室溫孵育1～2 h。加入適量ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Quantity One軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AU對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠CFs增殖的影響

Ang Ⅱ干預(yù)組的OD值較空白對(duì)照組明顯升高（P < 0.05）；低濃度AU干預(yù)組CFs增殖活性比Ang Ⅱ干預(yù)組略低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。中、高濃度AU干預(yù)組CFs增殖活性均明顯低于Ang Ⅱ干預(yù)組（P < 0.05），且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖1。

2.2 AU對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠CFs產(chǎn)生Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響

Ang Ⅱ干預(yù)組的膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ含量較空白對(duì)照組明顯升高（P < 0.05）；低、中、高濃度AU干預(yù)組的膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的生成均被顯著抑制（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 AU對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠CFs產(chǎn)生ROS的影響

與空白對(duì)照組比較，Ang Ⅱ干預(yù)組CFs的ROS水平明顯升高（P < 0.05）；低、中、高濃度的AU呈濃度依賴性地抑制ROS的產(chǎn)生（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。

2.4 AU對(duì)p38MAPK蛋白磷酸化的影響

與空白對(duì)照組比較，Ang Ⅱ干預(yù)組細(xì)胞中p-p38/p38比例明顯升高（P < 0.05）。與Ang Ⅱ干預(yù)組比較，低濃度AU干預(yù)組的細(xì)胞p-p38/p38比例輕微下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而給予中、高濃度AU干預(yù)組的細(xì)胞p-p38/p38比例相較于Ang Ⅱ干預(yù)組出現(xiàn)明顯的降低（P < 0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

心肌纖維化的病理表現(xiàn)為心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過(guò)度沉積及各型膠原比例失調(diào)且排列紊亂[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，CFs的異常增殖及大量的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積是心肌纖維化的重要原因。目前，產(chǎn)生ECM的CFs成為藥物治療心肌纖維化的重要靶標(biāo)。本研究探討了AU對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs增殖和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。本研究結(jié)果顯示，AU能呈濃度依賴性地抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs增殖和Col Ⅰ和Col Ⅲ的分泌，提示AU可通過(guò)抑制CFs的增殖和減少ECM沉積來(lái)抑制心肌纖維化。

ROS是氧化系統(tǒng)中產(chǎn)生的不穩(wěn)定、高活性氧分子化合物的統(tǒng)稱，主要包括含氧自由基、氧的非自由基衍生物、氫過(guò)氧化物等，它可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡[12-13]。ROS己被證實(shí)為心肌纖維化形成和進(jìn)展的重要因素之一。研究[14-15]表明，ROS在CFs增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積過(guò)程中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，AU在抑制CFs增殖和下調(diào)Col Ⅰ和Col Ⅲ水平的同時(shí)，ROS生成也顯著下降，提示抑制ROS的生成是AU抑制CFs增殖和下調(diào)Col Ⅰ和Col Ⅲ水平的的主要機(jī)制之一。

MAPK信號(hào)通路是介導(dǎo)刺激信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核內(nèi)并作出反應(yīng)的一個(gè)主要系統(tǒng)[16]。MAPK家族的信號(hào)通路主要有3組：外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extra -cellular signal-regulated kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）和p38-MAPK，均參與了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[14]。研究[17]表明ROS的產(chǎn)生可激活MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)CFs增殖和ECM過(guò)度沉積，從而導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，AU在抑制ROS的生成的同時(shí)，抑制了p38-MAPK的激活，提示AU可通過(guò)抑制ROS-p38MAPK通路來(lái)抑制CFs的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的生成。

眾多研究[18-20]表明，中藥對(duì)心肌纖維化具有良好的療效，如：野黃芩苷、橙皮素和柚皮苷等。本研究提示，AU可通過(guò)抑制ROS-MAPK通路的激活，有效地抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs的增殖和ECM的生成，這一結(jié)論為研發(fā)以AU為基礎(chǔ)的抗心肌纖維化藥物提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2018-09-26 本文編輯：金 虹）