孫艷麗,陳 飛,陳 武

(吉林省腫瘤醫(yī)院 1.內(nèi)二科；2.核醫(yī)學(xué)科,吉林 長春130012)

近年來靶向腫瘤微環(huán)境成為腫瘤治療的新途徑,腫瘤微環(huán)境是由低氧、低PH和大量生長因子等構(gòu)成的一個復(fù)雜系統(tǒng)。缺氧誘導(dǎo)因子1α被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤組織過表達(dá),是腫瘤適應(yīng)缺氧微環(huán)境的重要調(diào)控因子。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是目前發(fā)現(xiàn)一種具有免疫抑制功能的重要細(xì)胞亞群,發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤組織內(nèi)浸潤,被認(rèn)為可促使腫瘤發(fā)生免疫逃逸,與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。本課題通過免疫組化方法研究結(jié)直腸癌患者組織內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子-1α及Foxp3的表達(dá)情況,分析其相關(guān)性以及探討兩者表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2014年1月至2015年1月行手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本60例,所有結(jié)直腸癌患者術(shù)前均未行放、化療或免疫靶向治療,同時另取距離組織邊緣6 cm非腫瘤的癌旁組織石蠟標(biāo)本為對照。其中男性38例,女性22例；年齡39-75歲(中位59歲)；術(shù)后病理診斷分期：T1+T2期28例,T3+T4期32例；Ⅰ+Ⅱ患者27例,Ⅲ+Ⅳ期患者33例；腫瘤分化程度：高中分化36例,低分化24例。

1.2 免疫組化染色

結(jié)直腸癌組織,癌旁組織均用4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片,然后常規(guī)脫蠟水化,采用SP法檢測組織中Foxp3和HIF-1α蛋白表達(dá)水平,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封片,光鏡下觀察結(jié)果,結(jié)果判斷由兩名病理科醫(yī)師閱片,陽性細(xì)胞胞漿或胞核染成棕黃色。主要抗體包括：鼠抗人Foxp3單克隆抗體(Life Span Bioscience公司,美國),兔抗人HIF-1α單克隆抗體(英國Biorbyt公司)。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化染色結(jié)果所有病理染色切片均有兩名病理科醫(yī)師參照相關(guān)免疫組化反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)對免疫組化結(jié)果進(jìn)行判定,以細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。采用半定量法依照染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞百分比進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度計分方法：無陽性染色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分；陽性染色細(xì)胞構(gòu)成比計分方法：無陽性染色細(xì)胞0分,陽性細(xì)胞百分比≤10%為1分,陽性細(xì)胞百分比11%-50%為2分,陽性細(xì)胞百分比51%-75%為3分,陽性細(xì)胞百分比>75%為4分。最終評分為染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)與陽性細(xì)胞百分比分?jǐn)?shù)的乘積?！?分,則代表陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理,Foxp3和HIF-1α在癌組織和癌旁組織的表達(dá)強(qiáng)度及結(jié)直腸癌病理程度的關(guān)系采用卡方檢驗,Foxp3和HIF-1α的表達(dá)相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Foxp3和HIF-1α在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Foxp3在腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞胞核中表達(dá),核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Foxp3陽性細(xì)胞。HIF-1α主要著色于腫瘤細(xì)胞核內(nèi)及部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi),以細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果,見圖 1。

結(jié)直腸癌組織中Foxp3的陽性表達(dá)率68.3%(41/60),HIF-1α的陽性表達(dá)率63.3%(38/60),相比于癌旁組織,均顯著上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表 1。

A：癌組織Foxp3表達(dá)。B：癌組織HIF-1α表達(dá)。C：癌旁組織Foxp3表達(dá)。D：癌旁組織HIF-1α表達(dá)。

表1 60例Foxp3和HIF-1α在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)[例(%)]

2.2 結(jié)直腸癌患者組織中Foxp3和HIF-1α表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系結(jié)直腸癌組織中Foxp3的陽性表達(dá)率與腫瘤的分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),腫瘤分期為Ⅲ期/Ⅳ期,腫瘤浸潤深度為漿膜下和漿膜及漿膜外,以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中的Foxp3陽性表達(dá)率高于腫瘤分期Ⅰ期/Ⅱ期、腫瘤浸潤深度為粘膜下層和肌層,以及淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而與性別、年齡、分化程度無關(guān)。見表2。

結(jié)直腸癌組織中HIF-1α的陽性表達(dá)率與腫瘤的分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),腫瘤分期為Ⅲ期/Ⅳ期,分化程度差,以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中的HIF-1α陽性表達(dá)率高于腫瘤分期Ⅰ期/Ⅱ期、分化程度好,以及淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而與性別、年齡、腫瘤浸潤深度無關(guān)。見表2。

表2 60例結(jié)直腸癌組織中Foxp3和HIF-1α的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系[例(%)]

2.3 結(jié)直腸癌組織中Foxp3和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性在結(jié)直腸癌組織中免疫組化染色中,Foxp3和HIF-1α的表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(r=0.409P<0.01)。見表3。

表3 60例結(jié)直腸癌組織中Foxp3和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性(例)

3 討論

近年來靶向腫瘤微環(huán)境成為研究的熱點,腫瘤微環(huán)境主要通過誘導(dǎo)新生血管形成,抑制免疫監(jiān)視和免疫反應(yīng),孕育腫瘤干細(xì)胞等促進(jìn)腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境調(diào)控著腫瘤的多種生物學(xué)行為,包括腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖和高代謝狀態(tài),導(dǎo)致腫瘤供血供氧相對不足,缺氧成為腫瘤組織中的常見現(xiàn)象,此時,腫瘤會作出一系列生物學(xué)行為改變以適應(yīng)缺氧的環(huán)境,缺氧誘導(dǎo)因子-1 (hypoxiainducible factor 1,HIF-1)就是啟動這一系列適應(yīng)性改變的一個重要因子。HIF-1α 為HIF-1所特有,它既是調(diào)節(jié)亞基也是功能亞基,決定HIF-1 的活性。缺氧應(yīng)激引起HIF-1α的聚集、活化,活化的HIF-1通過與相應(yīng)的靶基因序列結(jié)合調(diào)控多種缺氧反應(yīng)基因的表達(dá),以維持腫瘤的細(xì)胞的自身氧穩(wěn)態(tài)及能量代謝平衡,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著極為重要的作用。

HIF-1α 在人類多種腫瘤中高表達(dá),早期臨床研究報道HIF-1α在13 種實體腫瘤中高表達(dá)[1]。此后陸續(xù)報道了在食管癌[2]、胃癌[3]、前列腺癌、乳腺癌[4]、卵巢癌[5]等一系列惡性腫瘤中HIF-1α的高表達(dá)。本研究中結(jié)直腸癌組織中HIF-1α的陽性表達(dá)率63.3%,顯著高于癌旁組織(P<0.01),與臨床報道相符[6]。此外本研究證實結(jié)直腸癌組織中HIF-1α陽性表達(dá)率與患者性別、年齡、腫瘤浸潤深度無關(guān),而與腫瘤的分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；腫瘤分期為Ⅲ期/Ⅳ期,分化程度差,以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直癌組織中的HIF-1α陽性表達(dá)率高于腫瘤分期Ⅰ期/Ⅱ期、分化程度好,以及淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)是一類具有免疫抑制功能的T 細(xì)胞亞群。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可分為多種亞型,其中最重要也是目前研究最多的為表達(dá)叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子FOXP3 的天然調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是forkhead/ winged-helix 轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員。作為重要轉(zhuǎn)錄因子對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的形成及免疫抑制功能起到至關(guān)重要的作用。Foxp3 是CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的特異性標(biāo)志,是參與腫瘤微環(huán)境中抑制免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)基因。

本研究結(jié)果表明Foxp3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.01),Foxp3陽性表達(dá)率68.3%,與臨床報道大致相符[7]。本研究證實隨著結(jié)直腸癌組織浸潤深度增加,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期增加,Foxp3表達(dá)進(jìn)一步增加,而與性別、年齡、腫瘤分化程度無關(guān)。結(jié)直腸癌患者Foxp3陽性表達(dá)與腫瘤微環(huán)境的免疫抑制相關(guān),隨著腫瘤的進(jìn)展及病變范圍擴(kuò)展,腫瘤細(xì)胞更易與機(jī)體免疫細(xì)胞直接作用或通過細(xì)胞因子介導(dǎo)的間接接觸,可能刺激CD4+ CD25+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg,使Foxp3在腫瘤組織中呈高表達(dá)的同時介導(dǎo)并增強(qiáng)Treg細(xì)胞的抑制功能,加深患者體內(nèi)免疫細(xì)胞對腫瘤的免疫耐受,促進(jìn)了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[8]。因此,本研究結(jié)果表明,隨著結(jié)直腸癌分期越晚,Foxp3表達(dá)越增加,免疫抑制越嚴(yán)重。

此外本研究分析發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中Foxp3和HIF-1α表達(dá)成正相關(guān)。且隨著結(jié)直腸癌組織出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期增加,Foxp3和HIF-1α表達(dá)進(jìn)一步增加,故聯(lián)合檢測Foxp3和HIF-1α在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá),有助于判斷結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移潛能及評估結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。