林芳，陳靜文，張志麒，劉呈雄，陳劍鋒，鄒坤，程凡，*

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.神農(nóng)架國(guó)家公園管理局，湖北 神農(nóng)架林區(qū) 442400）

睡眠，是高等脊椎動(dòng)物周期出現(xiàn)的一種自發(fā)的和可逆的靜息狀態(tài)，對(duì)人類身體健康極為重要。隨著社會(huì)生活節(jié)奏的加快，人們生活壓力的增加使得越來(lái)越多的人出現(xiàn)睡眠問題。目前市面上的的鎮(zhèn)靜催眠藥主要為巴比妥類和苯二氮卓類藥物，但是該類西藥治療極易伴隨有困倦乏力，頭暈嗜睡等不良反應(yīng)，長(zhǎng)期服用可能出現(xiàn)成癮性，突然停藥會(huì)有戒斷反應(yīng)[1]。而傳統(tǒng)安神中藥鎮(zhèn)靜安神效果明顯，副作用小的優(yōu)點(diǎn)，目前市面上即可用作藥品又可作為食品的安神類藥材主要有酸棗仁，百合等。

睡菜（Menyanthes trifoliate L.）為龍膽科睡菜屬多年生沼生草本，又名“醉草、綽菜、瞑菜”，以全草或葉入藥，具有“食之令人思睡”的神奇功效?！侗狈匠Ｓ弥胁菟幨謨?cè)》曰：睡菜味甘微苦，性溫，無(wú)毒，能健脾消食，養(yǎng)心安神[2-3]。民間部分地區(qū)有春夏季節(jié)采摘睡菜做泡菜的習(xí)慣，食用后使人思睡，睡菜也可作為啤酒的苦味劑，目前民間部分地區(qū)已將其作為安神類食物使用，但目前筆者尚未見對(duì)睡菜的鎮(zhèn)靜催眠活性和急性毒性活性的評(píng)價(jià)報(bào)道。

現(xiàn)有研究表明，睡菜所屬的龍膽科植物中含有的化合物結(jié)構(gòu)類型豐富多樣，主要含有環(huán)烯醚萜類、黃酮類、三萜類、揮發(fā)油類以及其他類型的化合物[4-5]，根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)特征分布于不同的極性部位，在課題前期已經(jīng)對(duì)睡菜總提取物鎮(zhèn)靜催眠活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步驗(yàn)證其藥理作用，為將睡菜作為安神保健類食物開發(fā)的后續(xù)研究提供理論依據(jù)，本課題初步對(duì)睡菜提取物灌胃小鼠急性毒性和鎮(zhèn)靜催眠活性部位進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠（SPF 級(jí)），（20±2）g，雌雄各半，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK（鄂）2017-0061；許可證號(hào)：SYXK（鄂）2017-0012，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)NO.42010200001498；NO.42010200001499。分籠飼養(yǎng)，自由飲水和攝食，適應(yīng)環(huán)境1 周后開始實(shí)驗(yàn)，控制室溫為（22±2）℃，濕度為（55±15）%。

睡菜樣品2016年8 月采集自湖北省神農(nóng)架大九湖，經(jīng)三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院王玉兵博士鑒定為龍膽科睡菜屬植物睡菜（Menyanthes trifoliate L.）的全草。干燥、粉碎后的睡菜全草經(jīng)95%乙醇回流提取，濃縮后浸膏用水懸浮，分極性萃取得到石油醚部位、乙酸乙脂部位、正丁醇部位和水部位。

戊巴比妥鈉鹽（批號(hào)：F0749）：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；地西泮片（批號(hào)：H1020898）：北京益民藥業(yè)有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YLS-1A 型多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀：上海欣軟信息科技有限公司；Gzx-9240MBE 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；N-1001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 睡菜提取物和萃取部位制備

睡菜樣品40℃恒溫干燥，經(jīng)藥物粉碎機(jī)粉碎后過篩，得到原藥材粉末。加入4 L 的95%乙醇，常壓回流提取3 次，每次2 h。提取液過濾后合并，50℃減壓濃縮得到總浸膏，浸膏提取率約10%?？偨嘤盟鶆蚧鞈?，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液減壓濃縮，真空干燥后得到各部位提取物，各部位提取率約為25%。實(shí)驗(yàn)時(shí)使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的羥甲基纖維素鈉（sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na）溶液進(jìn)行配置。

1.3.2 睡菜總提物小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 小鼠急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)

小鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分組稱重，每組6只，分為5組。設(shè)定劑量等比級(jí)數(shù)為1∶0.7，睡菜總提取物劑量分別為 2.4、3.43、4.9、7、10 g/kg。按不同劑量配制相應(yīng)濃度的藥液，最大給藥濃度10 g/kg，各組給藥體積均為0.4 mL/10 g，觀察并記錄小鼠的死亡情況。

1.3.2.2 小鼠急性毒性最大耐受量實(shí)驗(yàn)

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，睡菜總提取物口服給與最大給藥容積以及藥物能溶解的最大給藥劑量，仍未有小鼠死亡，因此進(jìn)行睡菜總提取物小鼠急性毒性最大耐受量實(shí)驗(yàn)。

取小鼠32只，雌雄各半，隨機(jī)分組稱重，每組16只，分為兩組即給藥組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，給藥組單次灌胃給與最大給藥濃度10 g/kg，最大灌胃體積0.4 mL/10 g；空白對(duì)照組給與相應(yīng)體積的0.5%的CMC-Na 溶液。給予藥物后每天至少觀察記錄2 次小鼠狀態(tài)，觀察指標(biāo)包括有小鼠外觀體征、行為活動(dòng)、呼吸、糞便性狀等。觀察期間保證小鼠喂養(yǎng)條件不變，發(fā)現(xiàn)死亡小鼠記錄死亡時(shí)間并及時(shí)進(jìn)行解剖，連續(xù)1 周每天定時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行觀察并記錄小鼠體重。1 周后將所有小鼠處死解剖[6-8]。

1.3.3 小鼠自主活動(dòng)影響實(shí)驗(yàn)

根據(jù)《中華本草》記載的睡菜用藥：睡菜，內(nèi)服：煎湯，10 g～15 g[9]。參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，人和小鼠按體表面積折算的等效劑量比值為0.002 6[10]。實(shí)驗(yàn)過程中，依據(jù)人的劑量為15 g，換算成小鼠劑量，睡菜小鼠給藥的生藥量為 1.95 g/kg（15 g/kg×0.002 6/0.02 kg），浸膏提取率10%，即總浸膏給藥量為0.195 g/kg，各部位萃取率均約為25%，即部位給藥低劑量為臨床劑量50 mg/kg，部位給藥高劑量組設(shè)為臨床劑量的4 倍，200 mg/kg。

小鼠100只，每組10只，隨機(jī)分為10組，即空白組、陽(yáng)性藥組（地西泮0.25 mg/kg）、石油醚部位組（50、200 mg/kg）、乙酸乙酯部位組（50、200 mg/kg）、正丁醇部位組（50、200 mg/kg）、水部位組（50、200 mg/kg）。按體重連續(xù)灌胃給藥7 d，空白組灌胃相應(yīng)體積的0.5%CMC-Na，末次灌胃給藥前，禁食不禁水12 h，末次灌胃給藥60 min 后，將各組小鼠置于自主活動(dòng)儀中，適應(yīng)5 min 后，開始測(cè)定各組小鼠的自主活動(dòng)情況，記錄10 min 內(nèi)小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)。

1.3.4 協(xié)同閾下劑量戊巴比妥鈉小鼠入睡率實(shí)驗(yàn)

戊巴比妥鈉劑量預(yù)實(shí)驗(yàn)，取30只小鼠，隨機(jī)分為5組，每組6只，分別腹腔注射戊巴比妥鈉，劑量為20、25、30、40、45 mg/kg。記錄 30 min 內(nèi)小鼠的入睡率，保持90%動(dòng)物不睡的最大劑量即為閾下劑量，而閾上劑量為保持所有動(dòng)物全部入睡的最小劑量。

實(shí)驗(yàn)分組如同小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)分組，按體重連續(xù)灌胃給藥7 d，空白組灌胃相應(yīng)體積的0.5%CMCNa，末次灌胃給藥前，禁食不禁水12 h。根據(jù)戊巴比妥鈉劑量預(yù)實(shí)驗(yàn)，選定腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾下劑量為25 mg/kg，可保持90%小鼠不睡，末次灌胃給藥60 min 后，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾下劑量25 mg/kg，觀察小鼠，60 s 翻正反射消失為發(fā)生睡眠，記錄30 min內(nèi)翻正反射消失的動(dòng)物只數(shù)，計(jì)算睡眠百分率。

睡眠百分率/%=入睡動(dòng)物只數(shù)/動(dòng)物總只數(shù)×100

1.3.5 協(xié)同閾上劑量戊巴比妥鈉小鼠睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分組如同小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)分組，按體重連續(xù)灌胃給藥7 d，末次灌胃給藥前，禁食不禁水12 h，空白組灌胃相應(yīng)體積的0.5%CMC-Na。根據(jù)戊巴比妥鈉劑量預(yù)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)戊巴比妥鈉劑量為40 mg/kg 時(shí)，小鼠并未全部入睡，劑量為45 mg/kg 時(shí)小鼠全部入睡，因此選定腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾上劑量為45 mg/kg，末次灌胃給藥60 min 后，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾上劑量45 mg/kg，觀察小鼠，記錄小鼠注射后到翻正反射消失的時(shí)間為入睡潛伏期，翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)的時(shí)間為小鼠睡眠時(shí)間[11-14]。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理。不同劑量組灌胃給藥后，引起的給藥組和對(duì)照組之間的差異顯著性采用單因素方差分析法進(jìn)行多重比較，閾下劑量戊巴比妥鈉實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Fisher 精確檢驗(yàn)分析。數(shù)據(jù)以表示，以P〈0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 睡菜提取物小鼠急性毒性

最大耐受量法評(píng)價(jià)睡菜提取物小鼠急性毒性，一般行為學(xué)觀察，與空白對(duì)照組相比，給藥當(dāng)天給藥組出現(xiàn)部分小鼠自主活動(dòng)減少，部分小鼠出現(xiàn)昏睡，但是易警醒而恢復(fù)正常活動(dòng)。1 h 后小鼠自主活動(dòng)逐步恢復(fù)正常。睡菜提取物對(duì)小鼠體重的影響結(jié)果見表1所示。

表1 睡菜提取物對(duì)小鼠體重的影響（，n=16）Table 1 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on weight gain in mice（，n=16）

表1 睡菜提取物對(duì)小鼠體重的影響（，n=16）Table 1 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on weight gain in mice（，n=16）

注：-表示灌胃同體積CMC-Na 溶液。

分組 劑量/（g/kg）給藥前/g給藥當(dāng)天/g給藥次日/g 1 周后/g空白組 - 19.7±0.8 22.0±0.9 22.5±1.2 30.4±1.7睡菜提取物組 10 18.9±0.9 21.7±1.2 21.4±1.6 28.8±2.9

由表1可知，與空白對(duì)照組相比，給藥當(dāng)日小鼠進(jìn)食量略微減少，體重降低，但毛色光滑，糞便，尿液，活動(dòng)未見明顯異常；第2 天小鼠活動(dòng)，攝食，體重增長(zhǎng)基本恢復(fù)正常，且1 周內(nèi)無(wú)動(dòng)物死亡。1 周后動(dòng)物體重均有增加，兩組動(dòng)物體重差異并不明顯。觀察期結(jié)束后對(duì)所有小鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀察給藥組動(dòng)物的主要臟器，與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。

2.2 睡菜提取物對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

睡菜提取物對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響結(jié)果如表2所示。

表2 睡菜提取物對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響（，n=10）Table 2 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the autonomic activity（，n=10）

表2 睡菜提取物對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響（，n=10）Table 2 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the autonomic activity（，n=10）

注：與空白組相比，*P〈0.05 有顯著差異。-表示灌胃同體積CMC-Na溶液。

組別劑量/（mg/kg）自主活動(dòng)次數(shù)空白對(duì)照組 - 128.5±9.14地西泮組 0.25 72.2±9.46*石油醚高劑量組 200 128.1±9.81石油醚低劑量組 50 127.2±8.92乙酸乙酯高劑量組 200 76.7±7.96*乙酸乙酯低劑量組 50 85.6±9.12*正丁醇高劑量組 200 72.2±12.92*正丁醇低劑量組 50 78.1±7.43*水部位高劑量組 200 136±9.07水部位低劑量組 50 131.8±11.71

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，睡菜提取物乙酸乙酯部位以及睡菜提取物正丁醇部位組的小鼠自主活動(dòng)次數(shù)明顯減少，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而睡菜提取物石油醚部位以及睡菜提取物水部位組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。

2.3 睡菜提取物對(duì)閾下劑量小鼠戊巴比妥鈉鎮(zhèn)靜催眠作用的影響

睡菜提取物對(duì)閾下劑量小鼠戊巴比妥鈉鎮(zhèn)靜催眠作用的影響結(jié)果如表3所示。

表3 睡菜提取物對(duì)小鼠入睡率（戊巴比妥鈉閾下劑量）的影響（n=10）Table 3 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the sleep rate in mice（n=10）

由表3可知，睡菜石油醚部位入睡率與空白組無(wú)明顯差異。睡菜提取物可增加閾下劑量戊巴比妥鈉小鼠入睡率，且睡菜提取物的乙酸乙脂部位，正丁醇部位以及水部位均能一定程度上增加閾下劑量戊巴比妥鈉的小鼠入睡率。陽(yáng)性藥物組入睡率為60%，乙酸乙酯高劑量組入睡率為60%，而正丁醇部位低劑量組入睡率為70%。乙酸乙酯部位和正丁醇部位戊巴比妥鈉閾下劑量鎮(zhèn)靜催眠作用明顯。

2.4 睡菜提取物對(duì)閾上劑量小鼠戊巴比妥鈉鎮(zhèn)靜催眠作用的影響

睡菜提取物對(duì)閾上劑量小鼠戊巴比妥鈉鎮(zhèn)靜催眠作用的影響結(jié)果如表4所示。

表4 睡菜提取物對(duì)小鼠睡眠潛伏期和入睡率（戊巴比妥鈉閾上劑量）的影響（，n=10）Table 4 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the latency of sleep and the sleep time of mice（，n=10）

表4 睡菜提取物對(duì)小鼠睡眠潛伏期和入睡率（戊巴比妥鈉閾上劑量）的影響（，n=10）Table 4 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the latency of sleep and the sleep time of mice（，n=10）

注：與空白組相比，*P〈0.05 有顯著差異。-表示灌胃同體積CMC-Na溶液。閾上劑量戊巴比妥鈉實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Fisher 精確檢驗(yàn)分析。

組別劑量/（mg/kg） 睡眠潛伏期/min 睡眠時(shí)間/min空白對(duì)照組 - 6.97±0.22 33.54±0.14地西泮組 0.25 4.01±0.18* 50.61±0.18*石油醚高劑量組 200 6.02±0.25 31.35±0.18石油醚低劑量組 50 6.01±0.26 32.78±1.39乙酸乙酯高劑量組 200 5.01±0.44 47.29±1.60*乙酸乙酯低劑量組 50 5.03±0.25 52.10±1.46*正丁醇高劑量組 200 3.3±0.31* 64.34±1.42*正丁醇低劑量組 50 4.05±0.18* 52.10±1.46*水部位高劑量組 200 6.06±0.24 37.32±0.95水部位低劑量組 50 5.95±0.18 36.08±1.01

由表4可知，與空白組相比，睡菜提取物石油醚部位、水部位的睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間均無(wú)明顯差異；而正丁醇部位高劑量組，正丁醇部位低劑量組，乙酸乙脂部位高劑量組，乙酸乙脂部位低劑量組可明顯縮短戊巴比妥鈉閾上劑量小鼠睡眠潛伏期，延長(zhǎng)睡眠時(shí)間。陽(yáng)性藥物組深度睡眠時(shí)間（50.61±0.18）min，乙酸乙酯部位低劑量組深度睡眠時(shí)間（52.10±1.46）min，正丁醇部位高低劑量組深度睡眠時(shí)間分別為（52.10±1.46）min 和（64.34±1.42）min。結(jié)果顯示，乙酸乙酯部位和正丁醇部位戊巴比妥鈉閾上劑量鎮(zhèn)靜催眠活性明顯。

3 結(jié)論與討論

相關(guān)文獻(xiàn)古籍對(duì)睡菜毒性及其安神功效早已有記載[2-4]，但至今，對(duì)其毒理和藥理活性研究甚少。為明確睡菜的安全性和藥效，也為后續(xù)將睡菜作為安神保健食物正式開發(fā)利用，本課題對(duì)睡菜提取物的小鼠經(jīng)口給藥急性毒性及其鎮(zhèn)靜催眠活性進(jìn)行了研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，睡菜提取物急性毒性的MTD 大于10 g/kg，證實(shí)睡菜提取物灌胃給藥的小鼠急性毒性較低，初步從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度對(duì)睡菜的食用安全性進(jìn)行了佐證。以地西泮作為陽(yáng)性對(duì)照，行為學(xué)評(píng)價(jià)睡菜提取物鎮(zhèn)靜催眠活性，鎮(zhèn)靜催眠活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，睡菜提取物具有較好的鎮(zhèn)靜催眠活性，通過對(duì)活性部位的追蹤，初步確定其鎮(zhèn)靜催眠活性部位為乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

對(duì)龍膽科植物化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，龍膽科植物乙酸乙酯部位的主要化合物類型為三萜類化合物[15]和黃酮類化合物，而正丁醇部位主要為環(huán)烯醚萜苷類化合物以及黃酮苷類化合物[16]?，F(xiàn)有研究對(duì)這幾種化合物鎮(zhèn)靜催眠活性研究均有報(bào)道，如酸棗仁中的鎮(zhèn)靜催眠活性成分斯皮諾素[17]，合歡花中的主要鎮(zhèn)靜催眠活性成分槲皮素，槲皮苷等[18-19]，以及龍膽科植物中的獐牙菜苦苷都有中樞神經(jīng)鎮(zhèn)靜作用[20]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道與實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相互佐證，睡菜乙酸乙酯部位和正丁醇部位的鎮(zhèn)靜催眠活性可能與這些類型化合物相關(guān)。

本課題為睡菜的食用安全性和藥理活性提供了一定的科學(xué)依據(jù)，也從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度佐證了睡菜的功效及其在古代的應(yīng)用，深化了中醫(yī)藥理論。睡菜具有毒性小且鎮(zhèn)靜催眠效果明顯的特點(diǎn)，本課題初步探究明確鎮(zhèn)靜催眠活性部位，在后續(xù)的研究中，將根據(jù)活性導(dǎo)向，進(jìn)一步探索睡菜鎮(zhèn)靜催眠活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為將睡菜正式開發(fā)為安神保健食品打下基礎(chǔ)。