沈國蔚，成心錕，顏世昌，張俊，丁惠民

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬明基醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210019）

囊性纖維化（Cystic fibrosis，CF）是一種常見的常染色體隱性遺傳病，是由于囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）編碼的基因突變引起的嚴(yán)重疾病，近年來亞洲發(fā)病率約1/10萬，呈上升趨勢[1，2]。CFTR是一種cAMP依賴的氯離子通道蛋白，廣泛表達(dá)于各組織的上皮細(xì)胞，介導(dǎo)離子和水分在上皮細(xì)胞的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)。CFTR功能異常是引起CF患者多系統(tǒng)病變的主要原因，主要臨床癥狀為CFTR功能異常所致脂類及其它營養(yǎng)素的吸收障礙、胰腺衰竭以及慢性感染或者細(xì)菌引起的二重感染導(dǎo)致的嚴(yán)重肺部功能障礙[3，4]，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。近年來研究表明，CFTR參與上皮細(xì)胞的凋亡過程[5]。然而CFTR和骨細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)研究尚未有報(bào)道，而本研究主要目的是探討CFTR在破骨細(xì)胞中的表達(dá)，以及CFTR對破骨細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人支氣管細(xì)胞系16HBE14，人破骨細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，胎牛血清及雙抗（青霉素、鏈霉素）購自美國Gibco公司，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，PVDF膜購自美國 Sigma公司，Lip2000、SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒購自日本TaKaRa公司，Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自凱基生物，CTFR、自殺相關(guān)因子（Factor associated suicide，F(xiàn)as）、Fas 配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde -3 -phosphate dehydrogenase，GAPDH），二抗購自美國Cell Sigaling Technology公司。主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，F(xiàn)ACSCanto流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，Elx800型自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司，7300型定量PCR儀購自美國ABI公司，Mini PROTEAN 3小型垂直式電泳儀購自美國Bio Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人支氣管細(xì)胞系16HBE14和破骨細(xì)胞，于37℃、5%CO2恒溫密閉細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天換液1次，待融合70%-80%時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RNA提取和real-time RT-PCR

TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，檢測CFTR mRNA表達(dá)水平。Real-time RT-PCR按照Roche FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）說明書進(jìn)行，相對基因表達(dá)采用2-ΔΔCT 法計(jì)算[7]。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡檢測（Western Blot）

細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液裂解提取蛋白，運(yùn)用BCA蛋白檢測法對蛋白進(jìn)行定量檢測，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫5%脫脂牛奶封閉1 h。然后加入一抗4℃孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測，Adobe Photoshop CS4軟件對條帶進(jìn)行灰度掃描檢測。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表目的蛋白相對表達(dá)量。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)

將人支氣管細(xì)胞系16HBE14和破骨細(xì)胞細(xì)胞接種6孔培養(yǎng)板中，1×106/孔，待轉(zhuǎn)染后，PBS沖洗后，加入Annexin V-FITC和PI，15 min后采用流式細(xì)胞儀檢測各組的細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way-ANOVA）進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFTR在破骨細(xì)胞中的表達(dá)

利用Real time PCR和Western Blot的方法，研究體外培養(yǎng)的人破骨細(xì)胞中CFTR的表達(dá)，并以人支氣管細(xì)胞系16HBE14為陽性參照。結(jié)果顯示（圖1a和1b），人破骨細(xì)胞無論是mRNA水平還是蛋白水平均有表達(dá)，但是較人支氣管細(xì)胞系16HBE14B的表達(dá)水平較低。

圖1 CFTR在破骨細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 CFTR對破骨細(xì)胞凋亡的影響和機(jī)制

2.2.1 構(gòu)建CFTR超表達(dá)載體

運(yùn)用基因工程手段[8]構(gòu)建含有GFP的CFTR超表達(dá)載體，通過病毒感染的方法導(dǎo)入體外培養(yǎng)的人破骨細(xì)胞中，從基因水平上調(diào)CFTR的表達(dá)，Western Blot驗(yàn)證CFTR蛋白表達(dá)上調(diào)，證明載體轉(zhuǎn)染成功（圖2）。

圖2 構(gòu)建CFTR超表達(dá)載體

2.2.2 超表達(dá)CFTR對破骨細(xì)胞凋亡的影響

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CFTR超表達(dá)后對破骨細(xì)胞凋亡率的影響，圖3結(jié)果顯示，SiRNA轉(zhuǎn)染組的凋亡率較對照組和空白轉(zhuǎn)染組顯著提高。結(jié)果證明，轉(zhuǎn)染后超表達(dá)CFTR，會(huì)促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡。

2.2.3 超表達(dá)CFTR對破骨細(xì)胞中Fas/FasL表達(dá)的影響

利用Real-time PCR和Western Blot法檢測體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞Fas/FasL的表達(dá)，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組凋亡相關(guān)蛋白Fas及FasL的表達(dá)，無論是mRNA水平還是蛋白水平，均較對照組及空白轉(zhuǎn)染組升高更為明顯。說明轉(zhuǎn)染后，CFTR高表達(dá)，通過促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Fas及FasL的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡，見圖4。

圖3 超表達(dá)CFTR對破骨細(xì)胞凋亡的影響

圖4 超表達(dá)CFTR對破骨細(xì)胞Fas/FasL表達(dá)的影響

3 討論

CF是一種常見的常染色體隱性遺傳病，是由于CFTR編碼基因突變引起的嚴(yán)重疾病，發(fā)病率約1/10萬[1,2]。CFTR是一種cAMP依賴的氯離子通道蛋白，廣泛表達(dá)于各組織的上皮細(xì)胞，介導(dǎo)離子和水分在上皮細(xì)胞的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)。CFTR功能異常是引起CF患者多系統(tǒng)病變的主要原因，主要臨床癥狀為CFTR功能異常所致脂類及其它營養(yǎng)素的吸收障礙、胰腺衰竭以及慢性感染或者細(xì)菌引起二重感染所致嚴(yán)重的肺部功能障礙[3,4]，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。近年來研究表明，CFTR參與上皮細(xì)胞的凋亡過程。在呼吸系統(tǒng)中，Durieu等[5]發(fā)現(xiàn)CFTR可以通過Fas和FasL促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞凋亡；在消化系統(tǒng)中，Rottner等[6]研究發(fā)現(xiàn)CFTR異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胰腺細(xì)胞過度氧化應(yīng)激引起凋亡增高；而在生殖系統(tǒng)中，研究發(fā)現(xiàn)CFTR在性激素刺激下高表達(dá)可能引起子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的增加，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜容受性[7]。

然而，CFTR和骨細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)性尚有待深入研究。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CFTR蛋白在人骨組織成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中均有表達(dá)，主要定位在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的細(xì)胞漿中[8]。Bronckers等[9]在人和小鼠的成釉質(zhì)細(xì)胞、成牙質(zhì)細(xì)胞以及骨細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)了CFTR的表達(dá)。這些結(jié)果提示，CFTR在骨質(zhì)維持中發(fā)揮一定的作用。最近，有研究對CFTR在骨代謝中的作用展開了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中，CFTR蛋白特異性抑制后會(huì)下調(diào)OPG并上調(diào)PGE2的表達(dá)，提示CFTR可能直接在骨組織中發(fā)揮作用，影響骨形成和骨吸收的穩(wěn)態(tài)[10,11]。因此，對骨組織中CFTR蛋白在維持骨代謝功能的深入研究，對于闡明CF骨病的發(fā)生具有重要意義。本研究利用Real time PCR和Western Blot的方法，研究體外培養(yǎng)的人破骨細(xì)胞中CFTR的表達(dá)，并以人支氣管細(xì)胞系16HBE14為陽性參照。結(jié)果顯示，CFTR在人破骨細(xì)胞低表達(dá)，進(jìn)而利用轉(zhuǎn)染技術(shù)，使破骨細(xì)胞高表達(dá)CFTR，且高表達(dá)CFTR促進(jìn)了破骨細(xì)胞的凋亡。

研究表明，F(xiàn)as/FasL途徑在細(xì)胞凋亡過程中起著十分重要的作用。它是TNF家族成員中，凋亡機(jī)制涉及范圍最廣泛的一條死亡相關(guān)受體通路。Fas是屬于TNF受體（TNFR）家族的一種膜受體，其配體FasL（CD95L）屬于TNF家族[12]。我們利用Real-time PCR和Western Blot法檢測過表達(dá)CFTR后破骨細(xì)胞中Fas/FasL的表達(dá)，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組凋亡相關(guān)蛋白Fas及FasL的表達(dá)，無論是mRNA水平還是蛋白水平，較對照組及空白轉(zhuǎn)染組，均表達(dá)升高。總之，本研究初步發(fā)現(xiàn)CFTR通過促進(jìn)Fas/FasL的高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡。